依达拉奉减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠氧化应激和炎性反应

程 涛，马程远，尹亚楠，孙贝贝

(1.南阳市第一人民医院 呼吸与危重症医学科，河南 南阳473000；2.河南省人民医院 呼吸内科，河南 郑州 450000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)简称慢阻肺，其发生受到外界环境因素及遗传因素等多方面的影响，吸烟是COPD最常见的危险因素，可导致肺部发生慢性炎性反应，损伤肺组织修复功能，大量释放的炎性因子又可进一步加重气道重塑，诱发肺大疱、肺气肿和间质性改变等典型COPD症状[1-2]。依达拉奉(edaravone，EDA)是一种脑保护剂，通过清除自由基、抑制脂质过氧化减轻脑细胞、神经细胞及血管内皮细胞的氧化应激损伤，脑梗死急性期给予患者EDA可增加梗死区周围局部脑血流量，有利于改善急性脑梗死所致的神经症状和功能障碍[3]。研究表明，EDA可通过抗氧化和抗炎作用对多种原因诱发的肺损伤产生保护作用，对COPD亦具有良好的治疗作用，但其作用机制尚不清楚[4-5]。本研究通过气管滴注脂多糖(lipopolysachrides，LPS)联合烟熏法制备大鼠COPD模型，观察EDA对COPD治疗的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：50只SD大鼠(SPF级，雌雄各半，6周龄，体质量180～220 g)，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2017-0011。研究方案获本院伦理委员会批准。

1.1.2 药品与试剂：EDA(国药集团国瑞药业有限公司)；大前门香烟(上海烟草集团有限责任公司)；LPS、HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；ELISA试剂盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd)；半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor α of NF-κB，IκBα)、磷酸化IκBα(pho-sphonated IκBα，p-IκBα)、Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)、β-肌动蛋白(β-actin)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)兔源单克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、建模及给药处理：50只大鼠被随机均分为对照组、模型组、EDA高剂量组、中剂量组、低剂量组。在模型组、EDA高剂量组、中剂量组、低剂量组的大鼠中建立COPD模型，造模方法见参考文献[6],在第1天和第14天时麻醉大鼠，气管滴注200 μL 1 mg/L LPS溶液，第2～13天和第15～28天时，每天20∶00将大鼠放置在密闭玻璃箱中定时烟熏30 min。对照组大鼠仅在其余大鼠滴注LPS时同时滴注等量0.9%氯化钠溶液，烟熏造模期间放置在密闭玻璃箱中但不进行烟熏处理。每次烟熏前，EDA高、中和低剂量组大鼠腹腔注射40、20、10 mg/kg的EDA，对照组和模型组动物不作给药处理，仅腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 检测肺功能：末次给药结束后2 h，用小动物肺功能检测仪检测大鼠肺功能指标，包括：静息呼吸频率[frequency of breathing,f(B)]、气道阻力(airway resistance，RI)、吸气峰流速(peak inhale flow，PIF)、动态肺顺应性(dynamic lung compliance，Cdyn)。

1.2.3 检测肺湿干重比(W/D)：处死大鼠，分离右上肺叶，记录湿重(W)，然后放置于恒温干燥箱(80 ℃)烘烤48 h，记录干重(D)，湿重与干重之比即为W/D。

1.2.4 ELISA检测肺组织SOD、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量：按照试剂盒说明书指定方法测定各因子的含量。

1.2.5 肺组织HE染色：将肺组织置于4%多聚甲醛中固定处理48 h，制作组织切片，脱蜡、复水后行HE染色。

1.2.6 Western blot：提取肺组织蛋白样品并测定其浓度，蛋白变性后按照30 μg/孔的上样量进行SDS-PAGE电泳，分离蛋白，电转至PVDF膜，再将PVDF膜置于5%脱脂奶粉中，放入恒温摇床，室温下封闭2 h，清洗，分别加入对应的一抗稀释液(1∶1 000)中，放入4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜，再放入二抗稀释液(1∶1 000)中，置于37 ℃摇床中继续孵育2 h，清洗后滴加适量的发光试剂，放入凝胶成像仪中显影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肺功能检测结果比较

模型组静息呼吸频率和RI高于对照组，而PIF和Cdyn值低于对照组(P<0.05)；与模型组比较，EDA高、中和低剂量组静息呼吸频率和RI回降，而Cdyn和PIF值回升(P<0.05)(图1)。

A.frequency of breathing;B.RI;C.PIF;D.Cdyn;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model group图1 肺功能检测结果比较Fig 1 Comparison of lung function test results n=10)

2.2 肺组织氧化应激水平和W/D比较

模型组肺组织SOD活力低于对照组，而MDA含量和肺W/D高于对照组(P<0.05)；与模型组比较，EDA高、中和低剂量组SOD活力回升，而MDA含量和肺W/D回降(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model group图2 肺组织氧化应激因子的含量和W/D值比较Fig 2 Comparison of the levels of oxidative stress factors and W/D in lung tissues n=10)

2.3 肺组织炎性因子水平比较

模型组肺组织炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量高于对照组，EDA高、中和低剂量组炎性因子的含量低于模型组(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model group图3 肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较Fig 3 Comparison of TNF-α,IL-1β and IL-6 contents in lung tissues n=10)

2.4 肺组织HE染色

与对照组比较，模型组大鼠肺组织炎性细胞浸润明显，肺泡壁增厚，肺间质水肿、充血。与模型组比较，EDA各剂量组大鼠肺组织炎性浸润和肺组织结构改变得到改善，高剂量EDA效果最佳(图4)。

A.control group;B.model group;C.EDA high dose group;D.EDA medium dose group;E.EDA low dose group

2.5 Western blot检测肺组织caspase-3、MMP-9和TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达

与对照组比较，模型组caspase-3、MMP-9、TLR4、MyD88表达增加，IκBα磷酸化水平显著升高，NF-κB p65 核内转移明显(P<0.05)；与模型组比较，EDA高、中和低剂量组caspase-3、MMP-9、TLR4、MyD88表达降低，IκBα磷酸化及NF-κB p65核转位水平降低(P<0.05)(图5，表1)。

A.control group;B.model group;C.EDA high dose group;D.EDA medium dose group;E.EDA low dose group图5 Western blot检测肺组织蛋白表达Fig 5 Protein expression in lung tissues was detected by Western blot

表1 各组大鼠肺组织蛋白表达水平比较Table 1 Comparison of lung tissue protein expression levels of rats in each group n=10)

3 讨论

EDA是一种自由基清除剂，临床常用于改善急性脑梗死所致的神经症状、日常活动受限和功能障碍。研究证明，EDA对COPD患者具有一定治疗作用，但其作用和机制尚不清楚[7]。本研究采用气管滴注LPS联合烟熏法制备大鼠COPD模型，结果显示，模型组大鼠肺功能降低，肺组织氧化应激损伤和炎性反应明显，表明慢阻肺大鼠模型建立成功。COPD患者常表现为明显的气流受限和阻塞性通气障碍[8]。在本研究中，EDA呈剂量依赖性提高大鼠肺功能，改善气流受限和通气障碍症状,减轻肺组织炎性浸润和结构改变，表明EDA可显著改善COPD肺组织功能结构损伤。

研究表明，香烟烟雾与COPD的发展密切相关，可诱导细胞凋亡、炎性反应及氧化应激，使肺组织损伤进一步恶化[9]。本研究显示，EDA呈剂量依赖性增加COPD大鼠肺组织SOD活力，降低MDA含量及炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，表明不同剂量的EDA均可减轻COPD大鼠肺组织氧化应激和炎性反应。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族是肺组织细胞凋亡调节机制的重要组成部分，caspase-3则是机体各种凋亡调节过程的中心环节，研究表明，COPD患者肺泡灌洗液中caspase-3的表达显著升高[10]。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类降解细胞外基质蛋白成分的基质降解酶，其中MMP-9在细胞迁移和气道炎性反应中起主要作用，在多种肺疾病中高表达[11]。在本研究中，EDA呈剂量依赖性降低肺组织caspase-3、MMP-9的表达。先天免疫的激活是炎性反应的第一防线，由模式识别受体，尤其是Toll 样受体(toll-like receptor，TLR)识别并启动，TLR4是该家族的重要成员，MyD88是TLRs家族下游炎性通路的经典分子，通过TLR家族成员与 IL-1R 相关激酶家族相互作用激活NF-κB信号通路，导致NF-κB抑制蛋白IκBα磷酸化，使NF-κB发生核转位，诱发并加重炎性反应，促进细胞凋亡，抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活可减轻炎性反应、氧化应激损伤和细胞凋亡[12-13]。本研究发现，EDA呈剂量依赖性降低TLR4、MyD88、NF-κB p65表达，表明EDA可抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化。

综上所述，EDA可改善COPD大鼠肺功能，减轻肺组织损伤及炎性和氧化应激水平。