Nrf2激活剂缓解低氧性肺动脉高压大鼠肺血管重构

葛 亮，向悦华，谭 旎

(恩施土家族苗族自治州中心医院 呼吸与危重症医学科，湖北 恩施 445000)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)主要特征表现为肺血管收缩增强和肺血管结构重建，低氧会造成PAH压力持续存在，是肺血管重建病理基础[1]，因此缓解血管重构对于PAH至关重要。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)在抗氧化中发挥重要作用，活化Nrf2可上调下游靶标，发挥抗氧化作用，改善内皮细胞紊乱，参与血管重构过程[2]。Nrf2/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路可调控下游靶基因磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1(NADPH quinineoxidoreductase-1，NQO-1)、血红素氧合酶1(heme oxygenase1，HO1)发挥抗氧化应激和实现对细胞的保护作用[3]。推测Nrf2激活可能通过影响上述通路实现对PAH的保护。因此，低氧诱导建立PAH大鼠模型，观察Nrf2激动剂莱菔硫烷(sulforaphane，SFP)对PAH大鼠的影响并初步探讨其作用机制，以期为临床治疗PAH提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：雄性SPF级大鼠，体质量180～220 g[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2017-0013]。饲养条件：光照/黑暗(12 h/12 h)、温度(23±1)℃、湿度(55±5)%，自由饮水饮食。本研究经恩施土家族苗族自治州中心医院动物伦理委员会审核并批准(文号：2019000412)。

1.1.2 试剂：SFP(TRC公司)；HE试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物岐化酶(SOD)检测试剂盒、胞质和核蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；一抗兔抗Nrf2、NQO1、HO1(Abcam公司)；一抗兔抗ARE(Santa Cruz公司)；基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2、MMP-9引物(由上海生工生物工程股份有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组：将大鼠分为对照组、低氧组、Nrf2激活组，每组8只。Nrf2激活组低氧处理前一周每天灌胃5 mg/kg SFP，连续4周，低氧处理：低氧大鼠饲养舱灌入氮气，维持氧浓度于10%±0.5%，每天8 h，每周6天，共3周复制PAH模型。

1.2.2 心肺血流动力学和右心室肥大指标的检测：检测大鼠平均肺动脉压力(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)，剪下右心室(right ventricular，RV)，称量RV和左心室(left ventricular，LV)+室间隔(interventricular septum，S)的重量，计算右心室肥厚指数=RV/(LV+S)。实验结束后立即将肺动脉组织部分置于4%多聚甲醛中固定，经石蜡包埋后切片。部分置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 HE染色检测肺血管重构：光学显微镜下利用血管图像分析仪，每只大鼠测定6条肺小动脉血管壁面积(wall area，WA)、血管总面积(total vaseular area，TA)、血管中膜厚度(mesothelium thickness，MT)及血管动脉外径(external diameter of blood tubular artery，ED)，计算WA/TA、相对血管中膜厚度(MT/ED)。

1.2.4 氧化应激指标MDA水平、SOD活性的检测：按照试剂盒说明书检测肺动脉组织中MDA(硫代巴比妥酸法)水平、SOD(氮蓝四唑法)活性。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测肺动脉中MMP-2、MMP-9 mRNA水平：RNA提取试剂盒提取总RNA，cDNA反转录试剂盒反转录为cDNA，MMP-2 上游引物：5′-TGTAAACAACTTTTGGACACATCTGGG-3′，下游引物：5′-AAATAGGTGACACGTGAAAAGTGCCTT GCA-3′；MMP-9 上游引物：5′-AGACACCTCTGCCCT CACCATGA-3′，下游引物：5′-AAGGTTAGAGAATCC AAGTTTATTAGAAACACTCC-3′；GADPH上游引物：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物：5′-TT GCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。反应体系20 μL：cDNA 1 μL、2×Mix 10 μL、F/R各0.5 μL、ddH2O 8 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、61 ℃退火80 s，45个循环。2-ΔΔCt法分析各组MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达水平。

1.2.6 Western blot检测肺动脉组织中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平：参照胞质和核蛋白提取试剂盒说明，分离细胞核和细胞浆，检测Nrf2蛋白水平。蛋白裂解液裂解提取肺动脉总蛋白，检测ARE、NQO1、HO1蛋白水平。凝胶电泳分离蛋白质、PVDF转膜、5%脱脂奶粉室温封闭，对应加入一抗Nrf2、ARE、NQO1、HO1、GAPDH、Lamin B1，4 ℃孵育过夜；加入对应二抗，室温孵育1 h。DAB显色试剂盒避光显色，蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Nrf2激活对大鼠心肺血流动力学和右心室肥大指标的影响

与对照组相比，低氧组mPAP、RV/(LV+S)水平升高(P<0.05)；与低氧组相比，Nrf2激活组mPAP、RV/(LV+S)水平降低(P<0.05)(表1)。

表1 3组大鼠mPAP、RV/(LV+S)水平比较Table 1 Comparison of mPAP and RV/(LV+S)levels of rats in three

2.2 Nrf2激活对大鼠肺血管重构的影响

与对照组相比，低氧组WA/TA、MT/ED升高(P<0.05)；与低氧组相比，Nrf2激活组WA/TA、MT/ED降低(P<0.05)(图1，表2)。

图1 3组大鼠肺动脉HE染色情况Fig 1 HE staining of pulmonary artery in 3 groups (scale bar=100 μm)

表2 3组大鼠WA/TA、MT/ED比较Table 2 Comparison of WA/TA and MT/ED in 3

2.3 Nrf2激活对大鼠肺动脉组织中MDA水平、SOD活性的影响

与对照组相比，低氧组肺动脉组织中MDA水平升高(P<0.05)、SOD活性降低(P<0.05)；与低氧组相比，Nrf2激活组肺动脉组织中MDA水平降低(P<0.05)、SOD活性升高(P<0.05)(表3)。

表3 3组大鼠肺动脉组织中MDA水平、SOD活性比较Table 3 Comparison of MDA level and SOD activity in pulmonary artery tissues of three groups of

2.4 Nrf2激活对大鼠肺动脉组织中MMP-2、MMP-9 mRNA水平的影响

与对照组相比，低氧组肺动脉组织中MMP-2、MMP-9 mRNA水平升高(P<0.05)；与低氧组相比，Nrf2激活组肺动脉组织中MMP-2、MMP-9 mRNA水平降低(P<0.05)(表4)。

表4 3组大鼠肺动脉组织中MMP-2、MMP-9mRNA水平比较Table 4 Comparison of mRNA levels of MMP-2 and MMP-9 in pulmonary artery of rats in 3 groups

2.5 Nrf2激活对大鼠肺动脉组织中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平的影响

与对照组相比，低氧组肺动脉组织中胞核Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平升高(P<0.05)，胞质Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)；与低氧组相比，Nrf2激活组肺动脉组织中胞核Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平升高(P<0.05)，胞质Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)(图2，表5)。

图2 3组大鼠肺动脉组织中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平Fig 2 Protein levels of Nrf2,ARE,NQO1 and HO1 in pulmonary artery tissue of rats in 3 group

表5 3组大鼠肺动脉组织中Nrf2、ARE、NQO1、HO1蛋白水平比较Table 5 Comparison of Nrf2,ARE,NQO1,HO1 protein levels in pulmonary artery of rats in 3 8)

3 讨论

研究发现，改善肺血管阻力和肺动脉顺应性，可以减缓血管重构，亦是目前治疗PAH的主要方法[4]。本研究发现，低氧组mPAP升高，低氧环境大鼠发生PAH。右心室肥厚指数RV/(LV+S)、WA/TA、MT/ED升高，低氧环境较常氧大鼠血管重构形成。

PAH肺血管组织内氧自由基生成过多，进而促使肺血管内皮细胞损伤，造成内皮血管屏障功能丧失，且MDA、SOD共同作用于肺动脉平滑肌细胞，诱导平滑肌细胞增殖增加、凋亡减少，导致血管壁增厚[5-6]。提示PAH肺动脉组织中氧化应激水平升高，组织中清除自由基能力降低，过氧化程度加重，机体氧化应激严重，肺动脉组织损伤严重。低氧刺激肺动脉平滑肌细胞发生表型转换，由收缩型变为合成表型可分泌MMP-2、MMP-9能力，导致肺血管重构形成[7]。提示PAH中MMP-2、MMP-9水平升高，平滑肌细胞发生表型转换导致肺血管重构形成。

Nrf2作为内源性抗氧化途径中枢转录因子，可调控抗氧化因子表达[8]。抗氧化治疗可激活Nrf2通过抑制内皮细胞向间充质细胞的转化从而抑制肺血管重构，实现对PAH的保护[9]。Nrf2/ARE信号通路直接影响细胞氧化应激水平，Nrf2转位进入细胞核，形成异二聚体可与ARE结合，同时可招募辅助转录因子，启动下游基因转录，实现抗氧化应激、抗炎损伤、抗细胞凋亡等多种功能，从而维持细胞环境相对稳定[10]。NQO1、HO1作为Nrf2/ARE信号通路下游转录因子，是抗氧化应激蛋白，具有抗氧化损伤作用[11]。PAH状态下发生氧化应激，刺激Nrf2核转移，实现对PAH的保护，但该保护水平有限，最终结果仍然加重PAH进程。激活Nrf2促进Nrf2入核，Nrf2入核后与ARE结合，招募NQO1、HO1实现抗氧化，同时减缓平滑肌细胞表型转化，减少血管重构，实现对PAH的保护。

综上所述，Nrf2激活可抑制PAH肺动脉血管重构，可能是通过实现抗氧化途径实现的。但影响血管重构途径较多，Nrf2亦可能通过别的相关途径抑制血管重构，也是本研究接下来的研究重点。