过表达内质网蛋白29抑制人卵巢癌细胞系OVCAR3侵袭和迁移

董莉丽，冯 磊，杨 然，李 松，饶玉梅

(1.南阳市中心医院 妇科，河南 南阳 473000;2.郑州大学第一附属医院 妇科，河南 郑州 450000)

卵巢癌(ovarian cancer)是妇科常见3大恶性肿瘤之一，过去10年间，中国卵巢癌发病趋于年轻化，发病率增长30%，病死率增加18%[1]。由于卵巢癌发病隐匿且缺少确切前期诊断方式，70%以上确诊时已进入中晚期，多数发生侵袭与转移，失去手术机会，仅能采取放射治疗、化学药物治疗等姑息治疗措施，预后差[2]。因此，探索抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭的有效方式，对改善其预后有重要意义。内质网蛋白29(endoplasmic reticulum protein 29，ERP29)是影响细胞增殖、转移的内质网蛋白之一，在多种肿瘤细胞中异常表达，参与乳腺癌、肺腺癌及结直肠癌的发生与发展[3-5]。本课题组经前期研究发现ERP29在卵巢癌组织中异常低表达，ERP29可能作为抑癌基因参与发病进程，但关于其对卵巢癌细胞侵袭、迁移的影响及具体机制仍需进一步探讨。本研究建立过表达ERP29的OVCAR3细胞系，探讨其对细胞迁移、侵袭的影响，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系:人卵巢癌细胞系OVCAR3(中国科学院上海细胞库)，保存于液氮中。

1.1.2 主要试剂:携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的真核表达载体pcDNA3.1-ERP29质粒、阴性对照载体pcDNA3.1 empty质粒(上海吉玛制药技术有限公司)；LipofectamineTM2000试剂盒(Invitrogen公司)；实时荧光定量聚合酶链反应(real-time-quantitative-polymerase chain reaction，RT-qPCR)SYBR Ⅱ试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白(mam-malian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR、真核生物始动因子4E结合蛋白1(4E binding protein，4EBP1)、p-4EBP1一抗(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养、转染及分组：将OVCAR3细胞培养于RPMI-1640培养基中(10%胎牛血清+1%抗青霉素、链霉素混合液)，常规条件5% CO2、37 ℃下培养至对数期行后续实验。调整细胞浓度为1×105个/mL，重新接种至6孔板，待细胞再次汇合至70%时，按LipofactamineTM2000试剂盒说明书进行转染。分为过表达组、空载组、对照组。过表达组用脂质体转染法转染ERP29过表达RNA重组真核载体pcDNA 3.1-ERP29质粒，空载体组转染阴性对照载体pcDNA 3.1 empty质粒，对照组不做处理。3组均设5个复孔，37 ℃培养6 h后更换为完全培养基，继续培养36 h。荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.2 RT-qPCR检测细胞中ERP29 mRNA表达量：取各组细胞，经PBS洗涤用Trizal法提取细胞总RNA，用反转录试剂盒获得对应的互补RNA(complementary RNA,cRNA)，定量后按荧光定量试剂盒说明书要求设置反应体系：上、下游引物(终浓度0.2 μmol/L)1.0 μL，2×Power qPCR PreMix 10 μL，DNA模板2.0 μL，加双蒸水至20 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。β-actin为内参基因，2-△△Ct法计算。引物序列：5′-TGCAGTGCAGTGC ACGCATGCTCA-3′(F)，5′-GTGCACACGGTTGTGTC CACCAAC-3′(R)。

1.2.3 Transwell小室实验测定细胞侵袭：将Matrigel(1∶9稀释)预先铺设于孔径8 μm、24孔趋化板Transwell小室中，恒温箱内胶干，取各组细胞无血清培养基上清液(培养24 h后)，下、上室中加入各组单细胞悬液，同条件培养24 h，取杯底滤膜，加入结晶紫避光染色、4 %多聚甲醛固定。取5个随机视野，显微镜下观察并记录穿膜细胞数。

1.2.4 划痕实验测定细胞迁移：胰蛋白酶消化重悬，调整细胞为1×105个/mL，接种至6孔板，细胞增殖至贴壁弃去培养基，用无菌枪头在孔中间画一条直线，用PBS冲洗直线边缘细胞至脱落，拍照记录初始划痕距离，加入完全培养基继续培养24 h，拍照记录新划痕距离，计算出各组迁移率。迁移率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.5 Western blot测定细胞中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4EBP1和p-4EBP1蛋白表达：用PBS冲洗，加入预冷RIPA裂解液，静置10 min后离心，BCA法测蛋白总量。沸水浴5 min使蛋白变性，取50 μg样本混合上样缓冲液，SDS-PAGE凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜，加入5%脱脂奶粉封闭1 h，加入AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4EBP1和p-4EBP1一抗(1∶1 000)4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗涤3次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶8 000)，室温孵育2 h后放入暗室显色、曝光，用Image J软件分析吸光度值，目的基因条带吸光度/内参β-actin条带吸光度即为蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 转染效率的测试

过表达组、空载组均有GFP绿色荧光蛋白表达，转染效率均大于80%，可用于后续实验(图1)。

图1 过表达组与空载体组转染效率观察Fig 1 Transfection efficiency of over-expression and empty vector groups

2.2 转染后各组ERP29 mRNA相对表达量对比

与对照组和空载组对比，过表达组ERP29 mRNA相对表达量升高(P<0.05)(表1)。

表1 各组ERP29表达水平Table 1 ERP29 expression levels in each

2.3 各组细胞侵袭能力对比

与对照组和空载组对比，过表达组穿膜细胞数减少(P<0.05)(表2,图2)。

图2 Transwell小室法观察各组穿膜细胞数Fig 2 Transwell experiment observation of the number of transmembrane cells in each group

表2 各组穿膜细胞数对比Table 2 Comparison of the number of penetrating cells

2.4 各组细胞迁移能力对比

与对照组、空载组对比，过表达组迁移率降低(P<0.05)(图3,表3)。

图3 划痕实验观察各组迁移能力Fig 3 Scratch experiment to observe the migration ability of each groups(×100)

表3 各组细胞迁移能力对比Table 3 Comparison of cell migration ability of each

2.5 各组细胞p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值对比

与对照组、空载体组对比，过表达组p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值降低(P<0.05)(图4，表4)。

图4 Western blot实验测定AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白表达量Fig 4 Western blot experiment to determine the protein expression of AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR, 4EBP1,p-4EBP1

表4 各组p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值对比Table 4 Comparison of p-AKT/AKT,p-mTOR/mTOR,p-4EBP1/4EBP1 values in each group

3 讨论

卵巢癌恶性程度极高，病死率居女性生殖系统恶性肿瘤之首[6]。关于其机制尚未完全阐明，通常认为与基因突变、遗传因子不稳定及基因异常表达有关[7-8]。目前,肿瘤细胞减灭手术辅以联合化学药物治疗(简称化疗)是卵巢癌的主要治疗方式，患者生存率得以提高，然而由于化疗耐药性的存在，5年生存率仍不足30%[9]。癌细胞的侵袭和迁移是导致治疗失败及患者死亡的主因。因此，探索抑制卵巢癌细胞侵袭迁移能力的有效方法至关重要。

ERP29最早在大鼠牙釉质细胞被发现，广泛分布于各种组织器官。ERP29作为内质网分子伴侣蛋白参与非折叠蛋白质反应，促使新生蛋白向正确的空间结构折叠，并有助于因应激而失活的蛋白质恢复正常，其上调可抑制细胞的迁移和侵袭能力，而下调具有相反作用，可通过抑制上皮间质转化过程、影响Wnt/β-catenin信号传导途径来阻止细胞转移。卵巢癌细胞中ERP29表达显著低于临近非肿瘤组织，且表达水平与肿瘤病理特征具有相关性，提示ERP29在卵巢癌细胞中低表达，参与卵巢癌进程[10]。本研究结果显示，与对照组和空载体组比较，过表达组ERP29表达升高，穿膜细胞数减少，迁移率降低，提示ERP29过表达可显著抑制OVCAR3细胞侵袭、迁移，与报道的结论相似[11]。

AKT/mTOR信号通路是细胞增殖的关键信号通路，广泛存在于各种细胞中，研究认为其活性异常增强与恶性肿瘤的发生、发展有着密切关系[12]。AKT是一种高度保守的丝氨酸苏氨酸蛋白酶，是维持细胞正常功能的关键信号分子，通过磷酸化为p-AKT被激活。mTOR蛋白是丝氨酸苏氨酸蛋白酶，是AKT下游重要靶点之一，被p-AKT激活后通过调控真核起始结合蛋白4EBP1，调节蛋白质合成从而影响细胞增殖。AKT/mTOR信号通路异常高表达于卵巢癌中[13]，采取对应干预措施使该通路失活，可减弱卵巢癌的恶性生物学特性。本研究结果显示，与对照组、空载组相比，过表达组p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值降低，提示上调ERP29对卵巢癌细胞侵袭、迁移能力的抑制作用可能与下调AKT、mTOR、4EBP1磷酸化有关。

综上所述，过表达ERP29可抑制卵巢癌细胞系侵袭、迁移，可能通过下调AKT、mTOR、4EBP1磷酸化发挥作用。本研究仍存在一定不足，在实验条件的限制下仅通过单一细胞系研究ERP29的作用略显牵强，在后续实验中将采用病毒感染或增加对照实验的方式进行更为深入的探索。