羟基红花黄色素A抑制人肝癌细胞系Huh7发生上皮-间质转化
2021-10-15李京敏白咸勇
吴 娜，王 东，李京敏，白咸勇
(滨州医学院 基础医学院 组织学与胚胎学教研室，山东 烟台 264003)
根据2018年最新统计，肝癌是世界范围内常见癌之一，也是癌相关死亡的第四大原因[1]。虽然肝癌的诊断技术和治疗方法取得很大进步，但是5年生存率仍然很低。因此，寻找有效无毒的方案对治疗肝癌迫在眉睫。在大多数肝癌患者中发现TGF-β 表达升高，并与其受体相互作用，激活细胞内TGF-β信号通路[2]。在肿瘤细胞中激活该通路可诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，上皮细胞失去底侧极性和细胞间黏附功能，出现间充质细胞的运动特征，使大量肿瘤细胞具备转移和侵袭的能力[3]。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)是从红花中提取的单查尔酮类结构化合物[4]。HSYA主要通过抑制血管生成，对肝癌和胃癌有直接的抗肿瘤作用[5]。本研究将通过体内体外实验研究 HSYA 对肝癌细胞迁移与侵袭的影响，从而为治疗肝癌提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SPF级裸小鼠，5周龄，雄性，12只，体质量18～22 g[济南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号：SCXK(鲁)20190003]；人肝癌细胞系Huh7(成都飞欧尔生物科技有限公司)；羟基红花黄色素A(上海源叶生物科技有限公司)；胎牛血清(Gibco公司)；DMEM 高糖培养基(HyClone公司)；山羊血清工作液、免疫组化试剂盒(兔二步法)、DAB 显色试剂盒和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG (二抗)(北京中杉金桥生物技术有限公司);兔抗 TGF-β1 单克隆抗体(中国Proteintech 公司)、兔抗vimentin和 E-Cadherin单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；ECL发光液(上海诺伦生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞的分组及处理：将人肝癌Huh7细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中，取对数增殖期细胞用于实验。对照组加入不含HSYA的培养基；实验组加入不同浓度的HSYA(80和160 μmol/L)处理。
1.2.2 细胞划痕实验检测细胞迁移：Huh7细胞以1×106/孔铺满6孔板，培养过夜后，用200 μL的枪头垂直于预先在6孔板底部画好的黑线划线。无菌PBS冲洗划掉的细胞，拍照并记录(记为0 h)。对照组和实验组细胞继续培养12和24 h，拍照并记录。用 ImageJ 软件测量划痕面积，计算伤口愈合百分比。伤口愈合百分比=(最初面积-某时间点的面积)/最初面积。
1.2.3 Transwell小室法检测细胞侵袭：培养Huh7细胞过夜后，加入0、80和160 μmol/L HSYA干预24 h后。胰蛋白酶消化离心，无血清培养基吹打混匀，以每孔1×105个细胞，置于预先铺有matrigel 胶的transwell小室内。在小室中加入200 μL细胞悬液，24孔板中加入含10% FBS的高糖DMEM培养基600 μL。37 ℃ 培养箱中培养12 h。取出小室，倾去培养基，PBS清洗2遍。4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS清洗2遍。结晶紫染色20 min，PBS清洗2遍。晾干后在倒置显微镜下(×200)随机观察 5 个视野。利用Image J软件统计细胞个数。
1.2.4 Western blot检测TGF-β1、vimentin和E-Cadherin蛋白表达：HSYA作用24 h后，加入含1% PMSF的RIPA裂解液，6孔板以每孔100 μL的裂解液裂解细胞，12 000 r/min离心20 min；取上清按照BCA试剂盒说明书测蛋白浓度；95 ℃加热蛋白10 min后-20 ℃保存；取蛋白每孔20 μg上样，进行 10% SDS-PAGE蛋白电泳，电泳完后，湿转法将蛋白转移到 PVDF 膜上；5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，根据分子质量的大小剪膜，加入兔抗GAPDH、E-cadherin、vimentin和TGF-β1单克隆抗体作为一抗4 ℃孵育过夜。第2天，将条带拿出室温孵育30 min后；TBST清洗4次，每次10 min；加入H&L羊抗兔 IgG二抗室温孵育1 h；TBST清洗4次，每次10 min；加入ECL发光液在凝胶成像仪下显影；利用Image J软件分析条带吸光度值。蛋白相对表达 =目的蛋白吸光度值 /内参蛋白吸光度值 ×100%。
1.2.5 动物的分组及处理：将Huh7细胞传代培养，以1×107个/100 μL接种于裸鼠腋窝中部外侧皮下，接种成功后，随机分成2组，移植组和HSYA实验组。根据本课题组之前的研究[6]，2.25 mg/kg HSYA是最佳治疗剂量，接下来以2.25 mg/kg HSYA为实验组。1周左右成瘤后，开始腹腔注射0.9%氯化钠溶液和HSYA，每天1次连续14 d。给药剂量按每1 g裸小鼠体质量注射10 μL。第15天处死裸鼠，进行取材固定。
1.2.6 HE和免疫组化染色：取裸鼠的肝脏和肿瘤(厚度4 μm)固定、脱水、包埋、切片。常规HE染色，倒置显微镜下观察组织形态。免疫组化染色参照说明书进行操作，微波修复抗原，过氧化物酶阻断剂阻断过氧化物酶，山羊血清封闭非特异性抗原，一抗E-cadherin(1∶400)、vimentin(1∶200)和TGF-β1(1∶200)孵育4 ℃过夜，DAB显色，倒置显微镜下观察组织阳性表达结果并拍照。利用Image-pro plus 6.0软件分析免疫组化图片，统计移植瘤组织中棕黄色阳性表达结果的累积吸光度值。
1.3 统计学分析
2 结果
2.1 HSYA抑制人肝癌Huh7细胞的迁移和侵袭能力
与对照组相比，80和160 μmol/L的HSYA实验组明显减少Huh7细胞的侵袭数量(P<0.05)(图1A)。随着时间延长，HSYA作用Huh7细胞12和24 h后，细胞迁移的数量明显少于对照组(P<0.05)(图1B)。
A.HSYA inhibited the invasion of Huh7 cells,scale bar=100 μm；B.HSYA inhibited the migration of Huh7 cells,scale bar=500 μm;*P<0.05 compared with control group
2.2 HSYA对人肝癌Huh7细胞vimentin和E-cadherin蛋白表达的影响
HSYA实验组vimentin表达量低于对照组，而E-cadherin表达量高于对照组(P<0.05)(图2)。
*P<0.05 compared with control group图2 HSYA对Huh7细胞中vimentin、E-cadherin蛋白表达的影响Fig 2 Effect of HSYA on expression of vimentin and E-cadherin in Huh7 n=3)
2.3 HSYA抑制人肝癌Huh7细胞在裸鼠肝内转移
移植组裸鼠肝脏中出现肝癌细胞转移和侵袭(P<0.05)(图3A，B)。移植组出现细胞核深染，肝细胞灶状坏死，肿瘤细胞浸润(如黑色箭头)。HSYA实验组无肿瘤细胞侵袭，肝小叶排列整齐。同时，移植组肿瘤细胞呈团状分布，组织结构清楚，少量坏死肿瘤细胞；HSYA实验组出现细胞核固缩，深染，灶状坏死灶(如黑色箭头)(图3C)。
A.appearance of liver and morphological changes of liver cancer,sacle bar=100 μm;B.puncta of tumor cell metastases;C.morphological changes of tumor tissue,scale bar=50 μm;*P<0.05 compared with control group
2.4 HSYA对移植瘤TGF-β1、vimentin和E-cadherin蛋白表达的影响
E-cadherin、vimentin和TGF-β1阳性表达分布在细胞质中，呈棕黄色。与移植组相比，HSYA实验组E-cadherin阳性表达升高，vimentin和TGF-β1表达降低(P<0.05)(图4)。
*P<0.05 compared with control group图4 Vimentin、E-cadherin和TGF-β1在移植瘤组织中的蛋白表达Fig 4 Detection of vimentin,E-cadherin and TGF-β1 protein expression in the transplanted tumor tissues by immunohistochemistry(×400)
3 讨论
TGF-β1作为TGF家族主要成员之一，在控制胚胎发育、炎性反应和组织修复以及维持人体组织内稳态方面发挥着关键作用[7]。此外，TGF-β 能够通过Smad或非Smad信号通路诱导EMT。EMT的发生伴随3个生物标志物E-cadherin、vimentin和N-cadherin不同程度的变化。这些变化可导致细胞间黏附减少、极性丧失，从而促进肿瘤血管的生成、转移和侵袭[2]。本课题组前期研究证实HSYA抑制H22昆明小鼠肝癌皮下移植瘤组织的血管生成；通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制肝癌细胞的增殖及迁移，并与PI3K抑制剂联合使用增强肿瘤细胞的凋亡[6,8]。本研究采用细胞划痕和Transwell小室法证明，HSYA能够抑制人肝癌Huh7细胞的迁移和侵袭；同时采用免疫印迹实验结果显示，HSYA干预人肝癌Huh7细胞后E-cadherin表达量增加，vimentin表达量下降，表明HSYA能够抑制肝癌细胞发生EMT。动物实验发现，与移植组相比，HSYA抑制裸鼠皮下移植肝癌细胞转移至肝内，HSYA实验组TGF-β1和vimentin表达降低，而E-cadherin表达升高，表明HSYA抑制了移植瘤细胞发生EMT。
TGF-β1 在肿瘤的发生发展中扮演双重作用[9]，早期通过免疫监视抑制肿瘤的发生。在肿瘤发生后促进肿瘤细胞迁移和侵袭，主要机制是TGF-β1能够诱导EMT，下调E-cadherin 及上皮其他基因和上调vimentin及其他间皮细胞的表达，从而增强细胞的迁移和侵袭能力。结合本研究结果，HSYA干预后，体外培养的人肝癌Huh7细胞发生迁移及侵袭的细胞数量减少；皮下移植瘤细胞未发生肝内转移；TGF-β1和vimentin表达降低，而E-cadherin表达升高。表明HSYA能够通过抑制肝癌细胞发生EMT，从而抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。在此研究基础上，本课题组将深入探究TGF-β 信号通路抑制肝癌侵袭和迁移的作用机制，为今后HSYA应用于临床肝癌治疗提供实验依据。
