LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达对评价肝癌患者预后的价值

刘浩瀚，江 帆，许诺然，徐 华，华 龙，朱 玉

(皖南医学院 公共卫生学院，安徽 芜湖 241002)

癌症作为一种疾病，病死率高，预后差，在全世界范围造成巨大的健康和经济损失。肝癌作为癌症相关死亡的第二大原因严重影响世界人民的健康[1]，我国肝细胞癌每年新发病例数、死亡数分别占全球54.6%、53.9%[2]。目前，对肝癌的致病原因仍然处于探索阶段，研究结果表明肝癌是基因和环境因素共同作用的结果。在我国，与肝癌密切相关的原因有很多，包括乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、长期酗酒、非酒精脂肪性肝病、进食黄曲霉毒素B1污染的食物、肝硬化等[3]。肝癌的预后效果也并不乐观，3年生存率为12.7%，中位生存期仅为9个月[4]。但随着二代测序技术的飞速发展，更多的基因功能及信号通路被挖掘，为探究肝癌的发生发展机制提供了重要基础，基因在肝癌中的预后研究也为临床实验提供方向。

本研究利用生物信息学方法，通过对公共癌症数据库(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的RNA表达谱数据及病人临床病理信息处理，探索人类内源性逆转录病毒组MER61成员1(LncRNA ERVMER61-1)的功能，LncRNA ERVMER61-1与核糖核苷酸还原酶调节亚基M2(ribonucleotide reductase regulatory subunit M2,RRM2)在肝癌中的表达状况、共表达关系以及预后作用，并探索LncRNA ERVMER61-1与RRM2在不同肝癌患者中表达特征以及对肝癌患者预后的价值，为探索抗肿瘤治疗提供新的预后标志物及潜在靶点。

1 资料和方法

1.1 资料来源 利用官方提供的gdc-client软件从TCGA下载肝癌组织样本和对照组织样本的RNA表达谱数据及患者临床病理信息，通过生物信息学方法处理数据。得到数据包含共有371例肝癌患者，其中319例患者提供了一份癌组织，50例患者提供了一对癌与癌旁组织，1例患者提供了一份癌组织和两份复发癌组织，1例患者提供了一份癌组织和一份复发组织，用于后续分析。数据截止日期为2019年8月19日。

1.2 研究方法 对之前已得肝癌的临床数据整理，并从基因表达谱中提取LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达量，基因表达量进行标准化。利用标化后的50对癌与癌旁组织数据，分析LncRNA ERVMER61-1和RRM2基因表达差异情况，利用371例癌组织数据分析LncRNA ERVMER61-1和RRM2共表达情况以及对患者预后的影响。使用K-M曲线法通过“survminer”包绘制RRM2和LncRNA ERVMER61-1的生存曲线，观察分析RRM2以及LncRNA ERVMER61-1和肝癌的预后生存关系。使用R软件“clusterProfiler”包对LncRNA ERVMER61-1共表达的基因做基因本体(geneontology，GO)富集分析,以P<0.05为筛选标准得到LncRNA ERVMER61-1共表达基因的相关功能。

1.3 统计分析 统计分析和绘图均在R 3.6.1中完成。肝癌与癌旁组织中LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达差异分析采用Wilcoxon符号秩和检验，肝癌组织LncRNA ERVMER61-1和RRM2共表达分析采用Pearson直线相关分析，LncRNA ERVMER61-1和RRM2对患者预后分析采用单因素以及多因素Cox回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA ERVMER61-1和RRM2在肝癌组织中表达水平上调 通过对TCGA中得到的50例包含一对癌与癌旁组织患者中LncRNA ERVMER61-1和RRM2基因表达含量的分析(图1)，结果表明LncRNA ERVMER61-1在肝癌组织中高表达，且与癌旁组织的表达含量差异有统计学意义(P=0.000)。RRM2在肝癌组织中高表达，差异有统计学意义(P=0.000)。

图1 LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达水平在肝癌组织中上调

2.2 LncRNA ERVMER61-1 GO功能富集分析 使用“clusterProfiler”包对LncRNA ERVMER61-1,共表达的基因做GO富集以P<0.05为筛选标准得到LncRNA ERVMER61-1共表达基因的相关功能(图2)。

图2 LncRNA ERVMER61-1的GO富集分析

2.3 LncRNA ERVMER61-1和RRM2的表达相关性以及在肝癌患者不同特征间表达分析 对肝癌组织中LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达的相关性分析，发现LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达存在正相关(r=0.316，P=0.000，图3)，验证了LncRNA ERVMER61-1可调控基因RRM2的表达。分析两基因表达水平在不同特征患者间的差异，发现LncRNA ERVMER61-1在不同性别间表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，RRM2在不同种族、肿瘤分期间表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图3 LncRNA ERVMER61-1和RRM2共表达情况

表1 LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达水平与肝癌患者特征情况的关系

2.4 LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达水平评价肝癌患者预后的价值 取两基因表达水平的中位数为节点，分为高表达与低表达，单因素Cox回归发现LncRNA ERVMER61-1高表达组患者死亡风险是低表达组患者死亡风险的2.324倍(95%CI：1.500～3.603)、RRM2高表达组患者死亡风险是低表达组患者死亡风险的1.597倍(95%CI：1.138～2.243)。结合患者特征进行多因素Cox回归，结果显示LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达和肿瘤分期影响肝癌患者的生存时间，LncRNA ERVMER61-1高表达是影响肝癌患者预后的因素，见表2。

表2 LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达水平与肝癌患者预后的关联

利用R软件的“survminer”包，分别画出LncRNA ERVMER61-1和RRM2的Kaplan-Meier曲线曲线(P<0.05)(图4)。

图4 LncRNA ERVMER61-1和RRM2不同表达水平肝癌患者的生存曲线

3 讨论

长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一类非编码RNA分子，不具有编码蛋白质的潜力，长度超过200个核苷酸[5]。LncRNA通过许多调控机制[6-7]被确定为各种细胞、生理和病理过程的参与者。人类基因组中LncRNA的确切数量仍不明确，但目前至少已经提出了60 000个LncRNA[8]。lncRNA作为一种潜在的生物学活性调节因子，广泛参与细胞活动。lncRNA几乎可以调控肿瘤细胞的各个方面，包括细胞生长、细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老、耐药性等[9]。因此，lncRNA成为抑制肿瘤及其致癌基因的调控靶点[10-12]。研究报道lncRNA可以在肝癌组织中发挥肿瘤抑制或致癌作用[13]，但lncRNA在肝癌的机制和功能仍在很大程度上未知，探究lncRNA的功能及在肝癌细胞中的表达水平，有助于支撑肝癌发生机制的探索。

Salmena等[14]在2011年首次提出竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假说。ceRNA极大地扩展了人类基因组中的功能遗传信息，并丰富了对肿瘤发生潜在机制的理解。在肿瘤发生发展过程中，ceRNA参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡及药物反应[15]等生物过程，为癌症相关研究、早期诊断及愈后治疗提供了新的研究途径。

LncRNA ERVMER61-1位于1号染色体长臂3区1号带1亚带。目前研究证明LncRNA ERVMER61-1为肝癌ceRNA网络调控中的一部分[16]，但其功能及在肝癌中的表达及预后的研究仍处于空白阶段。本研究表明LncRNA ERVMER61-1在肝癌中高表达，GO富集表现LncRNA ERVMER61-1可能与近端启动子序列特异性DNA结合、染色质结合、RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合、GTP酶结合、DNA结合转录激活剂活性、RNA聚合酶特异性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、被动跨膜转运蛋白活性、底物特异性通道活性、金属离子跨膜转运蛋白活性、小GTP酶结合有关。分析LncRNA ERVMER61-1表达水平在不同特征患者间差异情况时发现其表达与性别差异有关，同时单因素生存分析发现LncRNA ERVMER61-1高表达患者死亡风险高，预后效果差，体现出癌基因特征。

RRM2又名R2、RR2、RR2M、C2orf48，位于2号染色体短臂2区5带1亚带，含有14个外显子。该基因编码核糖核苷酸还原酶的两个不同亚基之一，该还原酶催化从核糖核苷酸形成脱氧核糖核苷酸。以细胞周期依赖性方式调节编码的蛋白质(M2)合成。核糖核苷酸还原酶是一种参与细胞周期的酶，由两个亚基组成，调节亚基RRM1和催化亚基RRM2[17-18]，这对DNA复制和修复至关重要[12]。已有研究证明异常上调的RRM2表达可通过增加dNTP积累来促进快速细胞分裂，并且因此涉及多种癌症，包括大肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、头颈癌[19-24]，RRM2还与宫颈癌的不良预后有关[25]。但RRM2在肝癌中的表达及预后研究仍未被提及。

本研究发现RRM2在肝癌中高表达，分析LncRNA ERVMER61-1表达在不同特征患者间差异情况时发现LncRNA ERVMER61-1的表达与种族及肿瘤分期差异有关，且单因素和多因素生存分析均发现LncRNA ERVMER61-1高表达患者预后效果差。同时发现LncRNA ERVMER61-1和RRM2表达存在正相关，进一步验证了LncRNA ERVMER61-1可调控基因RRM2的表达。

综上所述，LncRNA ERVMER61-1与RRM2在肝癌中高表达，且患者高表达时预后效果差。LncRNA ERVMER61-1可能通过调节RRM2在肝癌进展中发挥作用，为探索抗肿瘤治疗提供一个新的预后标志物及潜在靶点，具有重要的临床意义。