胃癌原发灶和区域淋巴结转移灶中锌指蛋白139、血管内皮生长因子的表达及临床意义

薛孝斌，刘刚，任冬莉

西安市长安区医院普通外科1、肿瘤科2、麻醉科3，陕西 西安 710100

胃癌是目前国内常见的消化道恶性肿瘤，我国胃癌病例每年新增超40 万，患病率位居癌症患病率第二，死亡率位居癌症死亡率第三[1-2]。胃癌临床进展较快，中晚期多出现区域淋巴结转移，根治术术后引起胃肠功能倒退常出现乏力、恶心和呕吐等不良反应，故胃癌预后较差，中晚期多采用保守药物治疗，探索其发病机制，找出影响病情进展主要节点并及时干预对控制胃癌转移、改善患者预后有重要意义[3-4]。锌指蛋白(zinc finger protein，ZNF)结构特殊，可与DNA、蛋白质等大分子相结合或ZNF-ZNF 相互结合进而参与基因转录的调控[5]。ZNF139属于ZNF家族，可通过调节基因表达进而参与细胞分化，与肿瘤分化转移关系密切，研究指出ZNF139能调节食管-胃交界腺癌肿瘤细胞增殖，在癌组织高表达[6]。肿瘤细胞增生对血供需求较高，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)高表达可促进血管内皮细胞大量增殖、加快血管新生进而促进肿瘤细胞增殖转移[7]。研究指出VEGF 高表达可介导肺癌肿瘤细胞的生长和转移，并参与结肠癌患者淋巴管生成并促进淋巴结转移[8]。因此，ZNF139 和VEGF 表达与肿瘤发生发展密切相关，研究两者表达与胃癌发生和转移的关系可为临床胃癌治疗药物研发提供一定思路。 尽管ZNF139和VEGF表达与胃癌发生相关研究较多，但有关两者表达与胃癌淋巴结转移关系研究较少，为此本研究将围绕这一重点开展研究，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2019 年2 月至2020 年8 月间在西安市长安区医院治疗且符合以下纳入和排除标准的78例胃癌手术患者，所有患者均经术后病理学检查为腺癌，其中42例伴区域淋巴结转移患者均取得相应转移淋巴结组织。78 例患者中男性44 例，女性34例；年龄38～75岁，平均(57.25±9.26)岁；肿瘤分化程度：低分化30 例、高分化48 例；据美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)对胃癌的TNM分期标准[9]分为Ⅰ～Ⅲ期，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期23例，Ⅲ期39例；肿瘤直径≤5 cm者45例、直径>5 cm者33例；伴淋巴结转移者42例。

1.2 纳入与排除标准纳入标准：患者为初次发病，年龄≥18岁；参照相关指南[10]标准，经病理检查确诊为胃腺癌；均行手术治疗且愿意配合术中病理组织留样；术前无抗肿瘤治疗既往史；研究获患者知悉同意。排除标准：病情危重者；伴其他部位恶性肿瘤者；伴先天性疾病及心、肺、肝、肾等严重器质性障碍者；伴严重免疫系统疾病者。

1.3 方法

1.3.1 ZNF139、VEGF 检测将分离组织的石蜡切片切为厚4.0 μm/片的薄片，脱蜡后通过免疫组织化学染色法将标本染色。首先用0.50%高锰酸钾浸泡水洗5～20 min，再用1.0%草酸浸泡2～5 min实现脱色(通过癌组织大小和镜下观察脱色度具体判定)，脱色后对抗原热修复25 min，将薄片置于3.0% H2O2室温下孵育12 min，柠檬酸钠伴高温促进抗原的修复，随后冷却10 min并清洗，使用小牛血封闭液封闭胃癌组织和转移淋巴结组织20 min后清洗3次，每次2 min。随后用兔抗人ZNF139单克隆抗体(美国Sigma公司提供)、鼠抗人VEGF 单克隆抗体(上海长岛抗体诊断试剂有限公司)；均按说明书配比稀释，稀释后在4℃环境下孵化一夜。清洗后37℃环境下孵化二抗半小时。再用链霉亲和素-生物素复合物免疫组化剂孵育半小时，复温50 min 后用链霉亲和素-生物素复合物免疫组化剂孵育0.5 min，二氨基联苯胺显色10 min，苏木素再染色5 min 后清洗、脱水、固定封片即可镜下观察。

1.3.2 染色观察结果判定标准细胞质或细胞核在镜下可见棕褐色颗粒物为ZNF139 和VEGF 表达阳性表现，其中VEGF主要集中在细胞质，对阳性细胞占比和染色强度进行分级计分，最后综合判定表达是否是阳性。ZNF139 和VEGF 染色强度评价标准：无色、淡黄、棕黄、棕褐依次对应0 分、1 分、2 分、3 分。ZNF139表达阳性显色细胞所占比例计分标准：≤15%、15%～55%、55%～75%、>75%依次记为1 分、2 分、3 分、4 分。VEGF 表达阳性显色细胞所占比例计分标准：<10%、10%～25%、26%～50%、>50%依次记为0 分、1分、2分、3分。ZNF139阳性判定标准：阳性细胞占比和染色强度评分相加为1 分计为阴性，>1 分计为阳性。VEGF 阳性判定标准：阳性细胞占比和染色强度评分相乘，0分为阴性，≥1分为阳性。

1.4 统计学方法应用SPSS18.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，计数资料比较采用χ2检验；两变量不满足直线相关性分析条件，采用Spesrman 相关性分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌原发灶和区域淋巴结转移灶中ZNF139和VEGF 表达率比较胃癌区域淋巴结转移灶ZNF139和VEGF表达率明显高于其在原发灶表达率，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1，其中ZNF139、VEGF免疫组化染色结果见图1和图2。

图1 ZNF139免疫组化染色(×400)

图2 VEGF免疫组化染色(×400)

表1 胃癌原发灶和区域淋巴结转移灶中ZNF139 和VEGF 表达率比较[例(%)]

2.2 胃癌癌组织ZNF139表达与临床病理特征的关系胃癌癌组织ZNF139 表达率与肿瘤分化度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)，见表2。

表2 胃癌癌组织ZNF139表达与临床病理特征的关系[n=78,例(%)]

2.3 胃癌癌组织VEGF 表达与临床病理特征的关系胃癌癌组织VEGF表达率与肿瘤分化度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)，见表3。

表3 胃癌癌组织VEGF表达与临床病理特征的关系[例(%)]

2.4 胃癌癌组织ZNF139与VEGF的表达与临床病理特征的相关性胃癌癌组织ZNF139 与VEGF 的表达水平与肿瘤低分化、TNM 高分期、淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，见表4。

表4 胃癌癌组织ZNF139与VEGF的表达与临床病理特征的相关性

3 讨论

据统计，胃癌发病率和死亡率在恶性肿瘤中排名中均靠前，严重威胁人类生命健康和生活治疗[11]。在胃癌发生和进展中，肿瘤细胞发生凋亡抵抗和凋亡调控逃逸，这促进了肿瘤细胞发生恶性增殖、转移，进而导致肿瘤细胞迅速蔓延[12]。此外，肿瘤局部丰富新生血对肿瘤细胞增殖、脱落和转移具有促进作用，严重影响化疗效果。故促进肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成对抑制胃癌淋巴结转移、改善患者预后意义重大[13-14]。既往研究中指出ZNF139 参与肿瘤细胞凋亡调控和增殖信号通路调控、VEGF 抑制剂一直作为恶性肿瘤患者抗血管生成化疗方案的主要用药[15-16]。两者与胃癌发生关系密切，但有关两者在胃癌原发灶及淋巴结转移灶间表达情况差异研究较少，故研究两者表达情况与淋巴结转移发生关系对胃癌淋巴结转移发生患者治疗药物研发有一定启发。

本研究结果显示，胃癌患者原发灶中ZNF139、VEGF表达阳性率低于区域淋巴结转移灶。YAO等[17]在研究中指出ZNF139 与其对应环状RNA 可参与激活PI3K/AKT信号通路，AKT属于原癌基因，经过磷酸化激活后可促进肿瘤细胞增殖转移和分化；李勇等[18]在研究中指出ZNF139可通过促进凋亡抑制蛋白表达来调控肿瘤细胞凋亡通路、抑制肿瘤细胞凋亡，故淋巴结转移多属于胃癌进展期，其病变程度较原发灶重，肿瘤细胞增殖分化程度和凋亡逃避能力较高，故ZNF139表达程度高。VEGF促进血管内皮细胞分裂、增殖进而产生丰富新生血管满足肿瘤细胞营养物质需求、促进肿瘤细胞发生淋巴转移、增加肿瘤细胞侵袭力[19-20]。故淋巴结转移灶多出现于胃癌中晚期，局部血管较原发灶丰富，VEGF 表达率较高，与修丽娟等[21]研究结果相似。

本研究结果显示，胃癌患者原发灶中ZNF139、VEGF表达阳性率与肿瘤分化程度、TNM分期、区域淋巴结转移呈正相关关系，这与李勇等[18]和王文廉等[22]结果相似，分析其原因可能是ZNF139高表达通过调控细胞凋亡基因Survivin、Bcl-2 来抑制肿瘤细胞凋亡；通过激活原癌基因AKT促进肿瘤细胞增殖转移，细胞形态与正常细胞差异大，故ZNF139 表达率与胃癌肿瘤低分化、TNM 高分期、淋巴结转移发生率呈正相关。VEGF 可与相应受体结合激活下游信号通路、靶向作用于血管内皮细胞、破坏血管结构稳定性来促进血管新生进而促进肿瘤细胞增殖分化[23-24]。此外，VEGF种类较多，其中VEGF-C 过表达可促进淋巴管生成进而诱发肿瘤细胞通过淋巴管发生淋巴结转移，与肿瘤进展关系密切，故VEGF 表达率与胃癌肿瘤低分化、TNM高分期、淋巴结转移发生呈正相关。

综上所述，胃癌发生区域淋巴结转移后ZNF139、VEGF 表达能力增强，两者表达情况与胃癌病情进展密切相关。