急性髓系白血病患者血清miR-10a-5p、miR-203表达与临床病理特征及预后的关系

郭亮，寇儒，李光，宋艳萍，蔺旭红，李真真

西安交通大学医学院附属西安市中心医院血液科1、检验科2，陕西 西安 710003

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种起源于髓系造血干祖细胞，以侵犯骨髓、血液以及其他组织器官的具有高度异质性的恶性克隆性疾病[1]。AML 的发病机制尚未完全阐明，目前有研究证实微小RNA (microRNA，miR)参与调控AML 发生发展、治疗以及预后等方面[2]。miR是一种进化高度保守的长度约为22 个核苷酸的短链非编码RNA，通过与目标mRNA 的3'UTR 特异性结合抑制信号通路的表达介导转录后基因沉默，miR主要由RNA聚合酶Ⅱ介导其转录过程，转录产物称为pri-miR，其特征在于发夹结构[3]。近年来随着研究的不断深入，发现miR 通过调控细胞增殖、分化、应激、自噬、凋亡、血管新生、骨髓微环境等方面促进白血病的发生发展[4]。因此了解miR 在AML 中的表达有助于人们更深入的理解AML 的发病机制，并探讨其在AML 分类、早期诊断、疾病预后、治疗等方面的应用价值。miR-10a-5p、miR-203是近年来新兴的参与肿瘤病理生理过程的分子生物标志物，两者在AML 患者中的表达水平及对预后影响的研究尚不多见。鉴于此，本研究通过检测初治AML 患者血清中miR-10a-5p、miR-203 的表达水平，进一步探讨其与临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2014 年7 月至2018 年1 月期间在西安市中心医院住院治疗的100 例初治AML患者(初治组)纳入研究。纳入标准：(1)临床资料完整；(2)符合世界卫生组织关于AML的诊断标准[5]；(3)患者或家属知情同意，且签署知情同意书；(4)均符合初治AML患者；(5)所有入组人员均耐受化疗。排除标准：(1)慢性髓系白血病；(2)严重心力衰竭或严重免疫缺陷者；(3)骨髓增生异常综合征；(4)合并其他肿瘤者；(5)严重感染者；(6)失访者。100例初治AML患者中有30例获得完全缓解(完全缓解组)，27例获得部分缓解(部分缓解组)，43例未获得缓解(未缓解组)。同期选取我院体检中心50例体检正常者作为正常对照组。初治组患者中男性56 例，女性44 例；年龄20～78 岁，平均(50.77±8.44)岁。正常对照组中男性25 例，女性25 例；年龄22～75 岁，平均(49.31±6.23)岁。两组受检者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 治疗方法100 例AML 患者均采取诱导化疗。其中CAG 方案治疗31 例：即静脉滴注阿克拉霉素10 mg/次，1 次/d，连续8 d；皮下注射阿糖胞苷10 mg/m2，2 次/d，连续14 d；皮下注射粒细胞集落刺激因子200 μg/m2，1次/d，且以患者白细胞计数>20×109/L为停药标准。MA方案治疗19例：即静脉滴注阿糖胞苷120～150 mg/m2，1次/d，连续3 d；米托蒽醌6～8 mg/m2，1 次/d，连续3 d。DA 方案治疗50 例：即静脉滴注阿糖胞苷120～150 mg/m2，1 次/d，连续7 d；柔红霉素35～45 mg/m2，1 次/d，连续7 d。

1.3 疗效评价标准按照《血液病诊断及疗效标准》[6]对100 例AML 患者的疗效进行评价：(1)完全缓解：治疗后各项症状彻底消失，且外周血PLT≥100×109/L，中性粒细胞计数≥1.5×109/L，白细胞分类中未检出白血病细胞，巨核细胞和红细胞恢复正常，骨髓内原始粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型≤5%；(2)部分缓解：治疗后血象、临床表现两项中存在1项未达完全缓解标准，且骨髓内原始粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型≤20%；(3)未缓解：血象、临床表现以及骨髓象均未达到部分缓解标准。

1.4 研究方法

1.4.1 临床资料收集收集AML 患者的临床资料，包括年龄、性别、脾肿大、染色体预后、白细胞计数(white blood cell，WBC)、血红蛋白(hemoglobin，HGB)、血小板计数(platelet，PLT)、造血祖细胞抗原CD34(hematopoietic progenitor cell antigen CD34，CD34)阳性率、核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)突变类型。

1.4.2 miR-10a-5p、miR-203 水平检测收集AML 患者入院次日清晨空腹状态下及正常对照组体检时的外周静脉血3 mL 置于5 mL 的EDTA 试管中，转速3 000 r/min离心5 min，吸取上层澄黄色液体至无菌的Eppendorf 管中，-80℃冰箱中保存备用。应用TRIzol 法提取AML 患者及正常对照组受试者血清总RNA，通过分光光度法验纯后根据说明书采用日本TaKaRa 公司的PrimeScriptTM逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。采用瑞士罗氏公司的实时荧光定量PCR 试剂盒和美国ABI 公司的ABI7500 荧光PCR 仪进行实时荧光定量PCR检测。采用Primer 5.0软件设计实时荧光定量PCR上下游引物，其中miR-10a-5p引物序列如下：上游，5'-GCGGCGGTACCCTGTAGATC CG-3'，下 游，5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'。miR-203 引物序列如下：上游，5'-AACCTTGCTCGTGAAATGTTTAG-3'，下游，5'-TATGCTTGTTCTCGTC TCTGTGTC-3'。扩增40 个循环，每个循环包括预变性95℃20 s，变性95℃10 s、退火57℃20 s、延伸72℃15 s。设定统一的CT 值分析实验结果，取3 次实验的平均值。使用cer-miR-39作为内源性对照，通过比较2-△△CT方法计算样本中miR-10a-5p、miR-203 的相对表达量。

1.4.3 随访所有患者均随访3 年，统计其生存情况，若中途死亡则随访终止。

1.5 评价指标比较初治组和正常对照组受检者的血清miR-10a-5p、miR-203 表达水平；比较完全缓解组、部分缓解组、未缓解组患者的血清miR-10a-5p、miR-203 表达水平；分析血清miR-10a-5p、miR-203 表达水平与AML 患者的临床病理特征的关系；分析不同miR-10a-5p、miR-203 表达水平AML患者的预后。

1.6 统计学方法应用SPSS23.0 统计软件分析数据，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±ss)表示，两组组间样本均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料组间比较采用χ2检验；单因素分析血清miR-10a-5p、miR-203 表达与临床病理特征的关系，生存数据分析采用Kaplan-Meier法，组间差异采用Log-rank 检验法，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常对照组与初治组受检者的血清miR-10a-5p、miR-203 表达水平比较初治组患者的血清miR-10-5p 表达水平明显高于正常对照组，而血清miR-203表达水平明显低于正常对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 正常对照组与初治组血清miR-10a-5p、miR-203 的表达水平比较(±s)

表1 正常对照组与初治组血清miR-10a-5p、miR-203 的表达水平比较(±s)

组别正常对照组初治组t值P值例数50 100 miR-10a-5p 0.11±0.03 0.36±0.11-15.756 0.001 miR-203 0.73±0.14 0.56±0.12 7.730 0.001

2.2 不同疗效AML 患者的血清miR-10a-5p、miR-203表达水平比较完全缓解组和部分缓解组的血清miR-10a-5p表达水平均低于未缓解组，且完全缓解组低于部分缓解组，差异均有统计学意义(P<0.05)；完全缓解组和部分缓解组的血清miR-203 表达水平均高于未缓解组，且完全缓解组高于部分缓解组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同疗效AML 患者的血清miR-10a-5p、miR-203 表达水平比较(±s)

表2 不同疗效AML 患者的血清miR-10a-5p、miR-203 表达水平比较(±s)

?

2.3 血清miR-10a-5p、miR-203 表达水平与AML 患者临床病理特征的关系以中位表达水平分别将100 例初治AML 患者分为miR-10a-5p 高表达组、miR-10a-5p 低表达组以及miR-203 高表达组、miR-203低表达组，单因素分析结果显示：100例初治AML 患者的血清miR-10a-5p、miR-203 的表达水平与脾肿大及WBC有关(P<0.05)，而与患者年龄、性别、染色体预后、HGB、PLT、CD34阳性率、NPM突变无关(P>0.05)，见表3。

表3 miR-10a-5p、miR-203表达与AML患者临床特征的关系[例(%)]

2.4 血清miR-10a-5p、miR-203 表达水平与AML 患者预后的关系截止随访结束时，100例初治AML 患者死亡55例，存活45例。其中miR-10a-5p高表达的AML 患者生存率为27.78% (15/54)，低于miR-10a-5p低表达的65.22% (30/46)，差异有统计学意义(Log-rank χ2=21.220，P<0.05)；miR-203高表达的AML患者生存率为55.77% (29/52)，高于miR-203低表达的33.33% (16/48)，差异有统计学意义(Log-rankχ2=14.706，P<0.05)，Kaplan-Meier生存率曲线图见图1。

图1 血清miR-10a-5p、miR-203表达水平与AML患者预后的关系

3 讨论

AML是成年群体中最为常见的急性白血病之一，占成年群体急性白血病的80%～90%，目前其发病机制尚未完全阐明[7]。研究显示miR调控着人体大约30%的基因表达，其可作为促癌基因或抑癌基因参与细胞增殖、分化、凋亡、发育、造血、器官形成等一系列重要的病理生理学过程[8]，同时miR 的发现和认识为深入探讨肿瘤发生发展的分子机制、临床诊断、靶向治疗及预后评估等方面开启了新的思路和方法[9]。

miR-10a-5p是近年来新发现的miR-10基因家族的成员之一，相关研究显示miR-10a-5p作为癌基因可与靶基因相互作用，进而参与多种肿瘤的发生发展，而miR-10a-5p在多种肿瘤中表达异常，但是在不同肿瘤类型中miR-10a-5p 的表达量具有一定的肿瘤异质性[10]。本研究结果显示，初治AML 患者血清中的miR-10a-5p表达水平明显高于正常人群，而完全缓解组和部分缓解组的miR-10a-5p 表达水平低于未缓解组，完全缓解组又低于部分缓解组，并且miR-10a-5p高表达的AML 患者预后较差，提示miR-10a-5p 可能是AML不良预后的影响因子，与ZHI 等[11]的研究结果相吻合，这可能与miR-10a-5p可通过抑制肿瘤细胞的凋亡有关[12]，既往已有研究显示敲低miR-10a-5p的表达可靶向抑制血小板反应蛋白2 (platelet reactive protein 2，THBS2)基因的表达，进而抑制胃癌细胞的生长和转移[9]。而支勇金等[13]检测到miR-10a在AML患者血清中普遍存在高表达，且与肿瘤负荷相关，提示miR-10a 高表达可能是AML 预后不良的分子标志物之一，但并未发现其表达水平与脾肿大和WBC有关，这可能是该研究样本量较少所致。

miR-203 定位于染色体不稳定脆性区域14q32-33，参与细胞分化、增殖、迁徙、转移、凋亡和自噬等生物学过程，同时miR-203还可通过与多种目标靶点如转录因子、分泌蛋白、受体、转运蛋白等相互作用而发挥功能[14]。此外，miR-203在血液系统肿瘤、食管鳞癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、喉癌、骨肉瘤等多种肿瘤中的表达下调，提示miR-203在肿瘤发生发展中起着抑癌基因的作用[15]。本研究结果显示，初治AML患者血清中的miR-203表达水平明显低于正常人群，而完全缓解组和部分缓解组的血清miR-203 表达水平均高于未缓解组，完全缓解组又高于部分缓解组，并且miR-203低表达的AML患者预后较差，提示miR-203在AML中发挥抑癌基因的作用，这可能是因为miR-203 可通过靶向抑制SRC、ABL基因的表达从而抑制肿瘤细胞的增殖[16-17]。ZHANG等[18]研究显示miR-203 在取自AML 患者的原代培养细胞中表达下调，并且miR-203 直接靶向survivin 和Bmi-1 mRNA 的3'非翻译区，影响白血病干细胞的增殖和自我更新，证明miR-203/survivin/Bmi-1 轴参与了白血病干细胞生物学特性的调控，以上结果均提示miR-203 的低表达与AML 患者不良预后可能有密切关系，临床可通过检测miR-203的表达水平评估AML患者预后不良的风险。

综上所述，miR-10a-5p、miR-203 在AML 患者中异常表达，且表达水平与脾肿大和WBC 有关，miR-10a-5p高表达及miR-203低表达均提示AML患者具有不良预后的风险。