角蛋白酶生产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究

徐志龙，尹雅洁，夏 险，梁运祥，赵述淼，胡远亮*

(1. 湖北师范大学生命科学学院，食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，黄石 435002；2. 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070)

角蛋白是一种硬质蛋白，在羊毛、羽毛和指甲等物质中含量丰富[1]，比如在禽类羽毛中粗蛋白的含量高达90%，其中主要为角蛋白[2]。这些物质通常是农产品加工副产物，无害化处理需要大量的资金投入。若有适宜的方法水解利用这些废弃蛋白资源，以代替畜禽日粮中价格昂贵的动物性蛋白原料，如鱼粉或肉粉等，将产生巨大的经济效益[3-5]。

角蛋白分子内和分子间存在大量的二硫键，其结构稳定，能抵抗大多数常见蛋白水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的降解作用[6]。采用传统的物理化学方法，高温、高压、强酸及强碱，不仅浪费大量的能源，增加环境负担，而且破坏氨基酸的生物学活性，大大降低了羽毛蛋白质资源的利用效率。

因此，筛选高效角蛋白降解菌，研究其所产角蛋白酶的性质，对羽毛粉资源化利用具有重要意义。本研究以羽毛粉为唯一碳氮源，从土壤环境中筛选高产角蛋白酶菌株，并对其酶学性质进行研究，为利用微生物发酵技术开发羽毛角蛋白饲料资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

从富含羽毛质的环境中采集土壤样品，3份样品分别采自江西省宜春市张巷镇、湖北省武汉市某家禽厂和咸宁市某家禽厂。

1.2 培养基

Luria-Bertani (LB)培养基：胰蛋白胨10 g⋅L-1，酵母提取物5 g⋅L-1，氯化钠10 g⋅L-1，pH 7.5，121 ℃灭菌、30 min。

羽毛粉培养基：羽毛粉10 g⋅L-1，K2HPO40.5 g⋅L-1，KH2PO41.2 g⋅L-1，NaCl 0.5 g⋅L-1，MgSO40.1 g⋅L-1，CaCl20.2 g⋅L-1，pH 7.5，121 ℃灭菌、30 min[7]。

1.3 初筛和复筛

称取10 g土壤样品，加入到90 mL的无菌水中，混合均匀并进行梯度稀释，然后涂布在羽毛粉平板上初筛培养，37 ℃、36 h。挑取生长良好的单菌落，在LB平板上进行分离纯化，纯化的单菌落继续接种至羽毛粉平板上验证培养，37 ℃、48 h，挑取生长情况良好的菌落保藏，同时按1.4方法所述测定角蛋白酶活力进行复筛。

1.4 角蛋白酶活力测定

将菌株接种至LB液体培养基，37 ℃、180 r⋅min-1培养24 h，取2 mL培养液接种至羽毛粉液体培养基，37 ℃、180 r⋅min-1培养36 h，离心8 500 r⋅min-1、5 min，取上清液1 mL，50 mmol⋅L-1的Tris-HCl缓冲液2 mL、羽毛粉50 mg，混匀，37 ℃水浴10 min，加入10%三氯乙酸2 mL作用15 min以终止反应。将终止反应液离心，10 000 r⋅min-1、5 min，取上清液于280 nm测定光吸收值。对照组首先加入10%三氯乙酸溶液2 mL抑制酶活性，然后加入上清液1 mL，其他条件保持一致[8-9]。酶活力单位定义：在该反应条件下，使稳定后280 nm光吸收值，每分钟增加0.01所需的酶量为1个单位[8-9]。计算公式如下：U=5n×ΔA280/(0.01×10)

式中：U为样品角蛋白酶活力（U⋅mL-1），5为终反应体积（mL），n为样品稀释倍数，ΔA280为实验组与对照组的光吸收值的差值，10为反应时间（min）。

1.5 菌株鉴定

将复筛获取的高产角蛋白酶菌株，在羽毛粉平板上划线培养，37 ℃，36 h。挑选单菌落，采用菌落PCR法，以通用引物27F/1492R扩增细菌16S rRNA基因进行鉴定，PCR反应程序为：预变性94 ℃，4 min；变性94 ℃，1 min，退火50 ℃，40 s，延伸72 ℃，45 s，循环30次；终延伸72 ℃，10 min[10]。将PCR产物纯化后送检测序，利用Genbank数据库中进行DNA序列BLAST，采用软件MEGA 5.0构建系统发育树。

1.6 酶学性质研究

pH值。分别配制不同pH值的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.2 mol⋅L-1，pH 4.0～7.0）、Tris-HCl缓冲液（0.1 mol⋅L-1, pH 7.5～8.0）和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（0.1 mol⋅L-1，pH 9.0～10.0），测定不同pH值条件下角蛋白酶活力，研究pH值对酶活力的影响。用pH 4.0～10.0缓冲液，以1∶1稀释酶液，4℃处理1 h，最适pH条件下测定角蛋白酶活力，以未处理组的酶活力为100%，研究该酶的pH稳定性。

温度。保持其他条件不变，分别于不同温度条件下（30～65 ℃），测定角蛋白酶活力，研究温度对酶活性的影响。酶液分别于60 ℃和80 ℃下处理1 h、2 h、4 h和8 h，最适条件下测定酶活力，以未处理组的酶活力为100%，研究该酶的温度稳定性。

离子和EDTA对角蛋白酶活力的影响。以终浓度5 mmol⋅L-1分别向反应体系中加入不同的离子（NH42+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+）或EDTA溶液，最适条件37 ℃，pH 7.5条件下测定酶活力，以蒸馏水为对照同时实验，计算相对酶活力。

表面活性剂、氧化剂和有机溶剂对酶活力的影响。反应体系以终浓度1%或5%的分别添加SDS，吐温80，H2O2；以终浓度1%分别添加甲醇、乙醇、二甲苯、异丙醇、异戊醇和甲醛，最适条件37 ℃，pH 7.5条件下测定酶活力，以蒸馏水为对照，分别计算相对酶活力。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

通过对3份土壤样品进行初筛，挑选生长良好的菌落进行分离纯化、保藏并测定角蛋白酶活力复筛（表1），结果表明编号KS12的菌株产角蛋白酶活力最高，达46.89 U⋅mL-1，选择该菌株进行鉴定并研究其角蛋白酶性质。

表1 测定角蛋白酶活力复筛结果Table 1 Result of keratinase activity

2.2 菌株鉴定

如图1A所示，LB平板上菌株KS12的菌落形态为半透明状，无反光，中间凹陷，边缘较厚，光滑且无规则。革兰氏染色镜检表明，菌体呈单个或链状排列，着色均匀，无荚膜，杆状，部分已产生孢子，初步认定为革兰氏阳性芽孢杆菌（图1）。

图1 KS12菌落形态和显微形态Figure 1 Colony morphologies and microscopic of strain KS12 on LB plate and feather powder plate

扩增16S rRNA鉴定表明，KS12菌株与Bacillus subtilisM015（KP192484.1）同源性最高，序列相似度为100%，且KS12菌株在系统发育树上进化距离与B. subtilis亲缘关系最近（图2）。因此，命名为B. subtilisKS12。

图2 系统发育树Figure 2 Phylogenetic tree of strain KS12 based on 16S rRNA

2.3 酶学性质研究

2.3.1 pH、温度对角蛋白酶活力和稳定性影响 如图3（a）所示，B. subtilisKS12产角蛋白酶在碱性环境中保持较高活力，最适pH值7.5；使用不同pH缓冲液处理1 h表明，该酶pH 8.0和9.0条件下，相对酶活力分别为97.2%和95.7%，见图3（b）。当pH＜4.0或＞9.0时，其稳定性快速下降，相对酶活力低于50%。

图3 pH和温度对角蛋白酶活力和稳定性的影响Figure 3 Effect of pH and temperature on activity and stability of the keratinase

研究发现，该酶最适反应温度37 ℃，当温度为30 ℃时，相对酶活力49.3%，达到45 ℃时，相对酶活力46.8%，见图3（c）。该酶于60 ℃，80 ℃水浴1 h，酶活力分别为61.4%，59.5%。随着保温时间的延长，角蛋白酶活力迅速下降，2 h酶活力不足5%，见图3（d）。这些结果说明，B. subtilisKS12产角蛋白酶对温度较为敏感。

2.3.2 不同离子对角蛋白酶活性的影响 如图4所示，5 mmol⋅L-1的Ca2+、Mg2+对B. subtilisKS12角蛋白酶活力有促进作用，其中Mg2+对角蛋白酶促进作用较强，相对酶活力达159%。EDTA则对酶活力基本没有影响，但Cu2+对角蛋白酶活力产生较强的抑制作用，相对酶活力仅有3.7%。

图4 金属离子对角蛋白酶活性的影响Figure 4 Effect of metal irons on keratinase activity

2.3.3 表面活性剂和氧化剂对角蛋白酶活性的影响由表2可知，SDS和H2O2抑制角蛋白酶活性。低浓度1%的吐温80对角蛋白酶激活作用不明显，但浓度为5%时，具有激活作用，相对酶活力达140.4%。

表2 表面活性剂和氧化剂对角蛋白酶活性的影响Table 2 Effect of various surfactants and oxidizer on keratinase activity

2.3.4 有机溶剂对角蛋白酶活性的影响 体系中以1%加入不同有机溶剂，发现角蛋白酶活力均受到抑制，说明该酶对有机溶剂的耐受性较差，其中，二甲苯的抑制效果最为明显，相对酶活力仅有34.1%（表3）。

表3 有机溶剂对角蛋白酶活性的影响Table 3 Effect of various organic solvent on keratinase activity

3 讨论与结论

以羽毛粉作为唯一的碳、氮源，筛选得到1株角蛋白酶产生菌，经鉴定并命名为B. subtilisKS12。芽孢杆菌被认为是极具潜力的角蛋白酶产生菌，研究表明Brevibacillus brevisUS575菌株所产的胞外角蛋白酶KERUS相比NUE 12 MG和KOROPON MK EG角蛋白酶具有更高的水解作用、底物特异性和催化活性，能够独立完成全部的羽毛降解[11]；来自B. tequilensisQ7的角蛋白酶KERQ7相比一些商业酶也具有更强大的角蛋白降解能力[12]。质谱分析KERUS单体分子量为29.1 KD，KERQ7为28.4 KD，两种酶都能够被PMSF和DFP完全抑制，表明属于丝氨酸蛋白酶家族[11]。

角蛋白酶的理化性质根据微生物的来源有所不同，大多数最适pH范围7.0～9.5，最适作用温度40～70℃[13-15]。来源于Purpureocillium lilacinumLPS#876的角蛋白酶在pH 4.0～9.0，37℃保温1 h，相对酶活力92%以上，65℃保温50 min，仍保持15%的相对酶活性[16]。少数角蛋白酶可以在极碱和更高温度下保持较高酶活性，比如来源于细菌Streptomyces的角蛋白酶，其最适作用pH和温度分别为11.5和75℃[17]。本研究中B. subtilisKS12酶学性质与多数角蛋白酶相似，在37℃和pH 7.5～9.0的碱性条件下较稳定。

金属离子Ca2+和Mg2+对B. subtilisKS12角蛋白酶活性有一定的促进作用，但重金属Co2+、Mn2+和Cu2+抑制角蛋白酶活性，通常Co2+[18]、Cu2+[19]和Hg2+[11,20]会不同程度的抑制角蛋白酶活性。螯合剂EDTA对B. subtilisKS12角蛋白酶的影响小，但对Bacillus thuringiensisAD-12分泌的角蛋白酶BtKER产生抑制作用[21]，该菌分泌的角蛋白酶与金属相关，因此，添加EDTA使其活性受到影响。

角蛋白酶活性受到表面活性剂SDS、氧化剂H2O2和有机溶剂不同程度的抑制。1%吐温80对B.subtilisKS12角蛋白酶无激活作用，但高浓度5% 吐温80提高角蛋白酶活性。研究结果与链霉菌分泌的角蛋白酶性质相似，当吐温80浓度为0.1%时，相对酶活力仅98%，但浓度为0.5%时，相对酶活力达到109%[21]。此外，有机溶剂的存在，均对该角蛋白酶产生抑制作用。

由于角蛋白性质坚硬，在环境中难被降解，因此，从自然界中很难筛选到可以高效分解羽毛角蛋白的微生物。以自然界中筛选的降解微生物为基础，构建基因工程菌，提高角蛋白酶在菌体中的表达量，其应用前景将更为广阔。