冬季补饲对妊娠后期藏母羊瘤胃挥发性脂肪酸、微生物群落结构和羔羊发育的影响

周 力，李蒋伟，张莹莹，张怀霞，马博妍，高占红，吴占月，侯生珍，王志有，桂林生

(青海大学农牧学院，西宁810016)

作为青藏高原及其毗邻地区的特有物种，藏羊对高海拔地区少氧、严寒和牧草匮乏等特殊恶劣环境具有良好的适应力，是高原畜牧业最为珍贵的种质资源[1]。长期以来，不仅为牧区人民提供生产及生活的必需品如肉、骨和毛等，同时也是青海省畜牧业经济的主要支柱之一[2]。由于青藏高原平均海拔4 000 m以上，严酷的自然环境和气候条件导致牧草生长期较短，枯草期长达9个月之久，而藏母羊妊娠后期正值枯草季节。由于枯草季节牧草中粗蛋白和脂肪含量只占青草季节的68.9 %和34.4%[3]，长期的营养摄入不足不仅影响妊娠期母羊分娩机能和产后恢复，同时还限制胎儿的正常生长发育。

作为反刍动物最复杂的生物体系之一，瘤胃微生物群落具有大量的基因资源。饲粮结构、宿主遗传和饲养管理等因素均能对微生物的内环境产生明显的影响[4]。饲粮作为微生物发酵的底物，其性质和组成直接影响微生物的定植过程。董春晓等[5]试验发现，相较于葵花籽壳组日粮和油菜秸秆组日粮,玉米秸秆组和玉米芯组日粮不仅可以确保育肥湖羊的生产性能, 并且有利于纤维分解菌的生存, 可促进纤维素在瘤胃中的降解。在羔羊上的研究发现，增加高谷物饲料的比例，能够显著降低瘤胃微生物群落的丰富度和多样性[6]。其他研究也指出在饲粮中添加植物油[7]、抗生素[8]、微生态制剂[9]以及维生素[10]等均能明显的影响瘤胃细菌结构，从而达到调控瘤胃发酵模式的目的。目前，关于冬季补饲对藏羊瘤胃微生物多样性的研究鲜有相关报道。基于此，本研究通过16 S rDNA高通量测序技术测定妊娠后期藏羊瘤胃微生物群落结构及功能的多样性，从微生物角度阐述冬季补饲对藏母羊瘤胃挥发性脂肪酸、微生物菌群及羔羊生长发育的影响，为促进藏羊生产力提供理论依据和技术途径。

1 材料与方法

1.1 试验动物及地点

选择年龄（3岁）、胎次（2胎）及体重（45.67±3.12 kg）相近的健康妊娠期藏羊440只，随机分为处理组（test，T）和对照组（control check，CK），每组220只。试验时间为2018年12月—2019年1月。养殖地点位于青海省海南州同德县河北乡夏知迈村。

1.2 试验设计

试验母羊同期发情，集中配种。妊娠前期（配种后0～105 d），所有母羊均为放牧饲养；妊娠后期（配种后106～150 d），处理组母羊在放牧基础上，归牧后每只母羊补饲0.1 kg·d-1精料补充料。对照组归牧进入圈舍后不接受补饲。所有试验羊放牧草场条件一致，自由饮水，归牧时间为每天19:30。藏羊未有现行饲养标准，参考中国肉羊饲养标准（NY/T 816-2004）[11]进行日粮配制。基础日粮组成和营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成和营养水平表（干物质基础）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets（DM basis）

1.3 样品采集

试验结束后，从试验组和对照组中随机选择 5只和 6 只母羊颈静脉放血屠宰后，采集瘤胃内容物于无菌离心管中，3 500 r·min-1离心 15 min，取上层液体混匀后通过4层纱布过滤，将滤液分为2份，一份装于5 mL冻存管中，用于测定瘤胃细菌多样性；另一份用于测定瘤胃液挥发性脂肪酸（VFA）含量。同时，每组随机选择100只新生羔羊，测定其体重、体高、体长、胸围及尻宽等生长发育指标。

1.4 瘤胃液VFA含量测定

参考Liang等[12]方法进行，利用气相色谱仪（Thermo Scientific，美国）测定瘤胃液挥发性脂肪酸的含量。

1.5 16 S rRNA PCR扩增

采用 E.Z.N.A.®stool DNA Kit（Omega Bio-tek,Norcross, GA, USA）试剂盒提取瘤胃液DNA。所提取的DNA质量及浓度通过Nanodrop 1000 spectrophotometer （Thermo Scientific，Wilmington，USA）进行检测。利用 Illumina HiSeq 2500 PE250 平台检测微生物V3+V4可变区多样性，分析瘤胃微生物多样性及不同水平丰度。PCR扩增上游引物为：5′-CCTAC GGGNGGCWGCAG，下游引物为5′-GGACTACHVG GGTATCTAAT。具体反应程序为：95 ℃ 2 min后进行35个循环，依次为 95 ℃ 2 min和72 ℃ 30 s，然后72 ℃延长 5 min。本试验中，将高度相似性的序列(97%)归为1个操作分类单位（Operational taxonomic units，OTU），测序数据采用UPARSE 软件进行OTUs聚类分析，相关图表采用R语言数据包进行绘制。

1.6 数据统计分析

试验数据采用Excel 2013对数据进行初步整理，利用SPSS 15.0 统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），T检验法比较2组数据的差异显著性，所有数据以平均值±标准差（mean±SD）表示，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 冬季补饲对新生羔羊生长发育的影响

由图1可见，冬季补饲能够显著影响新生羔羊的体重、体高和胸围。处理组羔羊的体重、体高和胸围分别比对照组羔羊高出29.07 %、11.82 %和12.69 %，差异显著（P＜ 0.05）。体长和尻宽差异不显著（P＞ 0.05）。

图1 冬季补饲对新生羔羊生长发育的影响Figure 1 Effect of dietary supplements on growth traits of lamb during the cold season

2.2 冬季补饲对妊娠后期藏母羊瘤胃液挥发性脂肪酸含量的影响

由表2可见，处理组瘤胃液总挥发性脂肪酸（TVFA）、丙酸和丁酸含量显著高于对照组(P＜0.05)；同时乙酸和异丁酸显著低于对照组（P＜0.05）。

表2 冬季补饲对妊娠后期藏母羊瘤胃液挥发性脂肪酸含量的影响Table 2 Effect of supplemental feeding in winter on volatile fatty acid content in rumen fluid of Tibetan ewes during late pregnancy

2.3 测序结果

本试验中，11份瘤胃液样本中总共获得原始序列1 252 166条，其中有效序列1 155 747条，序列度盖度为92.30 %。相似度大于97 %的有效序列聚类为3418个OTU，其中2194个OTU为2组母羊共有，637个OTU为对照组独有，587个OTU为处理组独有。

2.4 冬季补饲对妊娠后期母羊瘤胃微生物Alpha多样性的影响

应用Wilcoxon法对Alpha多样性中Chao1、Ace、Shannon和Simpson等指数进行分析（表3），结果显示，与处理组相比，对照组的Shannon 指数和Simpson 指数分别显著（P＜ 0.05）。Chao1 指数和Ace 指数方面，两组间差异不显著（P＞ 0.05）。

表3 瘤胃微生物Alpha多样性指数Table 3 Alpha diversity indexes of rumen microbiota

2.5 冬季补饲对妊娠后期母羊瘤胃微生物Beta多样性的影响

基于Unifrac算法在OTU水平上对瘤胃微生物进行principal co-ordinates analysis （PCoA），图3（a）结果显示，2组藏羊聚类明显，说明冬季补饲对藏羊瘤胃微生物区系存在具有显著的影响。此外，为更好地反映数据的非线性结构，对2组藏羊样本进行nonmetric multidimensional scaling（NMDS）分析，结果进一步佐证了两组藏羊瘤胃微生物区系差异明显（图3（b））。

图3 Beta多样性分析Figure 3 Analysis of Beta diversity

2.6 冬季补饲对妊娠后期母羊瘤胃微生物相对丰度的影响

门水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）以及疣微菌门（Verrucomicrobia）相对丰度较高，2组和分别占细菌总量的55.80 %、16.56 %及14.75 %，为优势菌门（表4）。通过对比排名前10菌门的差异发现，2组的3个优势菌门差异并不显著（P＞ 0.05），但处理组的蓝藻菌门（Cyanobacteria）的丰度仅为0.98 %，比对照组低1.04 %（P＜ 0.05）。

表4 门水平上瘤胃细菌组成分析Table 4 Composition analysis of rumen bacteria at phylum level

属水平上，普雷沃菌属-1（Prevotella-1）、理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae-RC9-gut-group）和普雷沃氏菌科-UCG-001（Prevotellaceae-UCG-001）为藏羊的瘤胃微生物优势菌属（表5）。通过对比排名前10菌门的差异发现，两组的3个优势菌门差异并不显著（P＞ 0.05）。

表5 属水平上瘤胃细菌组成分析Table 5 Composition analysis of rumen bacteria at genus level

2.7 功能预测

利用Tax4Fun软件进行KEGG Pathway的功能性注释，结果如图4所示，2组妊娠期藏母羊瘤胃微生物主要富集于复制和修复（replication and repair）、碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）、信号转导（signal transduction）、氨基酸代谢（amino acid metabolism）、辅因子和维生素代谢（metabolism of cofactors and vitamins）、核苷酸代谢（nucleotide metabolism）和能量代谢(energy metabolism)等功能通路。

图4 KEGG注释分布图Figure 4 Distribution graph of KEGG annotation

3 讨论与结论

3.1 冬季补饲对新生羔羊生长发育的影响

青藏高原恶劣的气候环境以及由于怀胎造成瘤胃挤压使得妊娠藏母羊营养长期摄入不足，造成产后瘫痪、生产弱羔或死羔现象频发。因此，科学补饲是维持妊娠藏母羊自身和胎儿发育必不可少的生产环节。董凌云等[13]研究发现，补饲颗粒饲料能够促进妊娠母羊的采食量、消化量和氮保留量，同时增加新生羔羊体重。此外，李联萍等[14]同样证实，妊娠母羊产羔前一个月补饲精料补充料能够提高羔羊存活率。本研究中，妊娠后期藏母羊补饲精料后，不仅能够提高新生羔羊的初始体重，同时还显著增加其体高和胸围指标，这与上述研究结果基本一致。推测可能存在2方面原因，首先补充精料可促进母羊血液中growth hormone（GH）、insulin-like growth factor-1（IGF-1）和insulin-like growth factor-1（IGF-2）浓度，而这些因子一定程度能通过刺激上皮细胞DNA合成，促进瘤胃上皮乳头发育，进而维持瘤胃功能[15]。其次，补饲精料为母羊提供了更为充足的碳源和氮源，促进瘤胃微生物的繁殖，维持瘤胃的正常功能[16]。故妊娠母羊营养的摄入充分能够最大程度上维持并促进羔羊的生长发育。

3.2 冬季补饲对妊娠后期藏母羊瘤胃液挥发性脂肪酸含量的影响

反刍动物瘤胃的发育状况与其发酵功能密切相关，瘤胃内微生物能够在厌氧条件下产生挥发性脂肪酸（包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等）和菌体蛋白，为机体提供能量和营养物质[17]。靳继鹏等[18]认为，高山细毛羊瘤胃乙酸/丙酸随着补饲料中粗料的增加呈现升高态势。刘敏雄[19]曾报道, 当粗饲料含量增高时, 纤维素分解菌占优势, 乙酸含量上升,而饲粮中淀粉含量高时, 分解淀粉的微生物占优势,丙酸含量显明显增多。Serment等[20]研究指出，在日粮维持需要的基础上再提高20%的能量, 能明显降低乙酸的含量，总VFA浓度会随精料比例的增加而上升, 乙酸/丙酸则下降。本试验中，对照组瘤胃液总挥发性脂肪酸（TVFA）、丙酸和丁酸含量显著低于处理组；同时乙酸和异丁酸显著高于处理组，这与上述研究结论相似。

3.3 冬季补饲对妊娠后期藏母羊瘤胃微生物菌落结构的影响

本试验通过多样性分析发现对照组的Shannon和Simpson指数分别显著高于和低于处理组，说明对照组瘤胃微生物多样性优于处理组。杨硕等[21]发现，补饲精料不但能够显著降低大青山绒山羊瘤胃细菌的OTUs 数量，同时还显著降低细菌的多样性。该结论与本研究相近。说明，尽管日粮中的精料可以在一定程度上能够为细菌提供更多的蛋白以及碳水化合物，保证细菌的生长量需求[22]。但是，伴随着精料的增加，非结构碳水化合物同样会随着增加，导致瘤胃产生乳酸和挥发性脂肪酸的大量生成，可能一定程度上降低了pH值下降，而过低的pH值不利于瘤胃中降解纤维物质的细菌的活性。

3.4 冬季补饲对妊娠后期藏母羊瘤胃微生物相对丰度的影响

反刍动物的瘤胃微生物群落结构和多样性受诸多因素影响，如营养、遗传以及宿主年龄等，尤其是日粮的结构组成、营养配比及饲喂方式进能显著影响瘤胃中微生物内平衡[23]。本研究结果揭示，妊娠后期藏母羊瘤胃微生物优势菌群分别是拟杆菌门和厚壁菌门，其相对丰度分别为55.80 %和16.56 %，该结果与Liu等[24]在山羊瘤胃微生物的研究结果一致。前期，诸多研究证实，日粮的类型和组成对瘤胃中拟杆菌门具有一定程度的影响[25]。王柏辉等[26]以苏尼特羊为研究对象，发现日粮中亚麻籽能够显著提高瘤胃细菌中拟杆菌门的相对丰度。本研究发现，冬季补饲有降低瘤胃拟杆菌门的趋势。结合拟杆菌门的功能，即通过靶向结合多糖，如纤维素、果胶以及木聚糖等，能够为宿主瘤胃微生物提供大量的碳源，进而参与机体的碳水化合物代谢[27]。

3.5 冬季补饲对妊娠后期藏母羊瘤胃微生物KEGG通路的影响

李海琴等[28]试验表明，湖羊瘤胃中占比最高的功能为碳水化合物的代谢，其次为氨基酸代谢，与COG数据库所预测的碳水化合物、转录和氨基酸运输与代谢功能一致。闫小兰等[29]试验显示，羔羊瘤胃内菌群功能主要集中在碳水化合物代谢和氨基酸代谢。本研究进行KEGG数据库对比分析后发现，复制和修复（replication and repair）、碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）、信号转导（signal transduction）等功能基因的相对丰度在2组中较高，与上述研究结果相似。补饲精料能够为瘤胃提供更多的营养物质，使得细菌主要富集于碳水化合物代谢相关通路。

妊娠后期藏母羊的冬季补饲能够提高瘤胃总挥发性脂肪酸、丙酸和丁酸的含量，同时为胎儿的生长发育提供必要的营养需求，但本研究中精料的摄入量一定程度上影响了母羊瘤胃细菌的多样性。因此，如何在维持胎儿营养需求和母羊瘤胃健康之间寻求平衡，是团队后期在藏羊营养调控方面研究的重点。