鸡粪堆肥中优势菌及复合固化菌剂载体的筛选

邵 颖，郑倩倩，赵鑫铭，宋祥军，涂 健，祁克宗

(安徽农业大学动物科技学院，兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室，安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室，合肥 230036)

畜禽养殖业的快速发展，与之而来的畜禽粪便的污染问题愈加突出。畜禽养殖业每年产生约38亿t畜禽粪便，但有效处理率不及50%[1]，养殖业粪便污染占农业污染总量的65%[2]。同时堆放的畜禽粪便会导致病原体污染、抗生素污染和重金属污染等，给公共卫生带来巨大的挑战。目前常用的干燥处理法存在投资大、耗能大以及处理温度过高带来肥效差和易烧苗等缺点[3]。因此研发安全且高效的堆肥复合菌剂处理畜禽污染具有重要意义。

堆肥是一种依靠自然界广泛存在的微生物以可控的方式促进可降解有机质转化为稳定有机质的生化过程[4]。堆肥作为养殖粪污无害化处理和资源利用的重要方式，本质是微生物腐化和矿化有机质形成稳定的腐殖质的过程[5]。从20世纪30年代开始，国内外就开始了对堆肥中所添加的微生物菌剂进行研制和应用。微生物菌剂已经成为制约堆肥效果的关键性因素[6]。常见的微生物菌剂主要有乳酸菌、芽孢杆菌、白腐菌和木霉等，其中芽孢杆菌（Baciillus）具有耐高温、快速复活和较强分泌酶等优势，是堆肥菌剂中使用最广泛的菌属。在有氧和无氧条件下都能存活，是环境中最常见的细菌类群，特殊的厚壁型结构与胞内组分具有良好的耐酸、耐碱和耐高温能力，能有效降低粪便中的臭味和氨气等有害气体。Schlegelmilch等[7]研究发现芽孢杆菌制作的复合菌剂对畜禽粪便有良好的除臭效果，氨气和硫化氢去除率较高。徐杰等[8]报道4株强纤维素降解芽孢杆菌，等比例混合进行堆肥，添加菌剂的堆肥中纤维素降解率提高19.83%，总氮损失率降低10%，同时具有良好的除臭效果等。

本研究以安徽规模养鸡场不同时期堆肥样品为研究对象，通过高通量测序分析了不同堆肥时期的优势细菌，以油脂、淀粉、纤维素、明胶分解性能和生理生化检测，筛选出3株芽孢杆菌，同时对菌株生长产酶条件进行单因素研究。并比较沸石粉、麦壳粉、稻壳粉和玉米芯粉4种载体的菌体接种有效活菌率以及菌体保存期等指标，确定了最佳细菌载体，为后期开展无害化处理养殖业所产生粪便污染的提供实用性研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品采集：选取安徽怀宁县规模蛋鸡养殖场槽式发酵床，堆肥前期（发酵2 d）、中期（发酵15 d）和腐熟时期粪样（发酵45 d），各时期3份，共计9份。

1.2 堆肥样品高通量测序分析

使用天根生化科技（北京）有限公司的细菌DNA提取试剂盒提取采集的鸡粪堆肥样品中的微生物DNA，经核酸测定仪检测合格后用于后续试验，PCR产物构建测序文库，上机测序以及测序结果的分析委托北京诺禾致源科技股份有限公司。

1.3 菌株的分离筛选

将样品稀释涂布LB平板35 ℃培养2～3 d，参照《常见细菌鉴定手册》[9]对细菌大小、形状、菌落、颜色和透明度等进行形态特征观察。通过生理生化试验、纤维素降解试验[10]、油脂降解试验[9]、淀粉降解试验[9]、明胶降解试验[9]以及16s rRNA测序，获得具有堆肥潜力的优势菌。

1.4 不同培养条件下纤维素酶活性测定

试验数据经过SPSS 21进行单因素方差分析，并以平均值与标准误标识，使用GraphPad Prism 7制作图片。

酶活计算公式：U=n(μmol) X /V(mL)T(min)（U:纤维素酶；n:葡萄糖含量；X:稀释倍数；V:反应液中酶液加入量；T:反应时间）

活菌率公式：R=N1/N2 （R:活菌率；N1:释放活菌数；N2：接种细菌数）

1.5 菌剂中有效活菌数的测定

地铁车厢普遍存在人流量众多、人员复杂和车厢内空间相对拥挤的情况，尤其高峰时期上述情况更为严重，因此提高地铁车厢乘客的舒适度这一问题亟待解决。

1.6 数据处理及分析

纤维素酶活性测定，按照国际标准[11]绘制葡萄糖标准曲线，采用DNS[11]（3，5-二硝基水杨酸）法测定不同温度、PH、碳源和氮源培养条件下发酵液中纤维素酶活性。24 h恒温培养，取0.2 mL发酵液50 ℃水浴10 min，然后加入2 mL DNS溶液，沸水浴5 min，冷却至室温后加水定容至5 mL，540 nm波长分光光度计检测。以煮沸灭活的发酵液为空白对照。并将不同碳源、氮源的发酵液梯度稀释，10 μL挂板记录活菌数。

2 结果与分析

2.1 鸡粪堆肥中不同堆肥阶段菌群的分类学组成分析

高通量测序中门水平上的物种聚类热图能体现堆肥不同阶段微生物群落的演替。如图1所示，不同时期堆肥样品中细菌的群落结构（X1为堆肥前期、F1为堆肥中期和F2为腐熟期）。在堆肥前期厚壁菌门和变形菌门相对丰富度较高，占总丰富度的61.72%；在堆肥中期和腐熟期放线菌门、拟杆菌门和异常球菌-栖热菌门相对丰富度较高，占总丰富度的38.29%。梭菌属（Clostridiaceae）多为致病菌，其菌群在堆肥初期占据优势地位，随着堆肥时间延长，梭菌属（Clostridiaceae）的相对丰度逐渐降低。芽孢杆菌属（Bacillaceae）在堆肥初期也属于优势菌群，仅次于梭菌属，表明芽孢杆菌属（Bacillaceae）细菌在堆肥前中期为活跃微生物，可以促进堆肥的腐熟。在堆肥期间芽孢杆菌相对丰度呈现先降低后增加趋势，推测堆肥中期由于温度升高，芽孢杆菌不在适应生存环境改变，随着堆肥温度下降，芽孢杆菌再次成为优势菌株。

新疆自治区纪委第五纪检监察室出具的《到案经过》称，根据群众举报反映谢晖的问题线索，纪检部门经初步核实后，发现其涉嫌严重违纪。2015年6月30日，经自治区纪委常委会研究，报自治区党委同意，决定对其立案审查。7月22日，中纪委网站发布了谢晖的落马消息。同年12月29日，谢晖被刑事拘留，2016年1月16日被逮捕。

图1 门水平上的物种聚类热图Figure 1 Heat map of species clustering on the level of gate

2.2 鸡粪中优势微生物的筛选与鉴定

LB琼脂平板初筛鸡粪样品获得的10株形态类似芽孢杆菌的细菌微生物，进行生理生化试验和底物降解试验，结果如表1和表2所示，筛选出3株优势微生物，D1能降解多种糖类和蛋白质，同时也能降解油脂和纤维素；D5能分解多种糖类、油脂、纤维素和明胶；D7也能分解多种糖类、油脂、纤维素和明胶，其中D1和D7两株菌降解性能最佳，D5次之。

纳米粒子3的合成。将5.000 g气相纳米二氧化硅(原生粒径12 nm)与200 mL乙醇的悬浊液超声处理12 min，然后转移至三口烧瓶中，氮气保护下加入KH550(1.500 g，6.787 mmol)和水(3.00 mL)，混合物在90℃机械搅拌下回流反应4 h。反应结束以后抽滤，以无水乙醇100 mL洗涤4次，滤饼真空干燥后得白色固体3。

表1 10株细菌的生化试验结果Table 1 Biochemical test results of 10 strains of bacteria

表2 10株细菌的代谢底物降解结果Table 2 Degradation of metabolic substrates from 10 strains of bacteria

2.3 16s rRNA测序鉴定菌株

图3（b）显示，3株菌最适的pH存在明显差异，3株菌对酸性环境较敏感，酶活较低，其中D1菌株pH为6.5时有显著差异（P＜0.05）且酶活性最高；D5菌株pH为7.5时有显著差异（P＜0.05）酶活性相对最高。D7菌株pH为7.0时有显著差异（P＜0.05）酶活性相对最高。3株菌适应的pH值存在明显差异，3株菌对酸性环境较敏感，酶活较低。

图2 菌株系统发育树状图Figure 2 Dendrogram of phylogeny of bacteria

表3 3株细菌序列比对结果Table 3 Sequence comparison results of three strains of bacteria

2.4 复合菌剂优势菌培养条件优化

测定D1、D5和D7 3株菌在不同培养条件下酶活变化。如图3（a）所示，在环境温度为41 ℃时，3株菌酶活差异显著（P＜0.05），其中D7菌株纤维素酶活性最高。

如表3、图2所示，3株细菌16s rRNA序列BLAST比对，D1与Bacillus amyloliquefaciens相似度达到98.66%，D5与Bacillus thuringiensis相似度99.76%，D7与Bacillus licheniformis相似度98.29%。D1，D5和D7均为亲缘接近的芽孢杆菌属。

图3（c）和图3（d）显示，以CMC-Na作为碳源时，D1和D5相较D7菌株有显著差异（P＜0.05）；以葡萄糖作为碳源时，D5和D7菌株产酶差异显著（P＜0.05）；以淀粉为碳源时，3株菌酶活较低；以麦芽糖作为碳源时，D1菌株产酶和其余3个碳源产酶有显著差异（P＜0.05），且酶活性相对最高。

增值税留抵税额一般是指企业的进项税抵扣销项税之后，由于不能抵扣完全而遗留下来的税额。留抵税额在企业普遍存在，形成的原因主要有三个，其一是企业销售收入并没有实现抵扣完全，有采购材料的遗留；其二是科技型企业因为研发技术及其他原因导致销项税额不能完全抵扣进项税额；其三是二者税率的不一致引起了留抵税额的产生。

图3（e）所示，以酵母提取物作为氮源时，3株细菌生长情况较好，存活率都高于100%。图3（f）所示，D1、D5和D7菌株以酵母提取物为氮源时酶活性最高，差异显著（P＜0.05）。

具有良好的抗压性能，这是保障路面可以承受重物反复碾压的先决条件，公路上的车流量大，载重较重，在实际的使用过程中，路面承受巨大的压力，严重影响密实度，机构会产生缝隙，会导致路面出现不同程度的沉降，所以在进行沥青材料配比是都应该保持其具有良好的抗压性能，使路面在使用中不会产生剪切破坏或弯曲疲劳破坏的现象。

按1∶1比例将菌液分别与灭菌晾干的沸石粉、稻壳粉、麦壳粉和玉米芯粉载体混合，静置晾干备用。取制备好的晾干菌剂样品稀释挂板后统计载体释放菌落数目，重复3次。

图3 （a）温度影响产酶的结果；（b）pH值影响产酶的结果；（c）碳源对细菌生长的影响；（d）碳源对产酶的影响；（e）氮源对细菌生长的影响；（f）氮源对产酶的影响。Figure 3 (a) Effect of temperature onenzyme production; (b) Effect of pH value on enzyme production;(c)Effect of carbon sources on bacterial growth; (d) Effect of carbon source screening onenzymeproduction; (e) Influence of nitrogen source on bacterial growth; (f) Effect of nitrogen source screening onenzyme production

各菌株的最适培养条件不同。D1菌株pH为6.5，培养温度41 ℃，碳源为麦芽糖，氮源为酵母提取物；D5菌株pH为7.5，培养温度41 ℃，碳源为葡萄糖，氮源为酵母提取物；D7菌株pH为7.0，培养温度41 ℃，碳源为葡萄糖，氮源为酵母提取物。

2.5 菌剂中不同储存期活菌数的测定

不同载体菌剂储存期内活菌数如图4所示，3株菌在玉米芯粉中存活率较高，在不同储存期内，菌剂的活菌数有一定差异。沸石粉作为载体效果较差，活菌数量较低，玉米芯粉和小麦壳粉保有较高活菌数。随着储存期的延长，玉米芯粉对D1、D5和D7菌株的保护性都较好，在储存28 d后活菌数依然较高。

图4 （a）D1菌株菌剂贮存的活菌数检测（CFU）；（b）D5菌株菌剂贮存的活菌数检测（CFU）；（c）D7菌株菌剂贮存的活菌数检测（CFU）Figure 4 Detection of viable bacteria number in the storage of strain D1, D5 and D7（CFU）

3 讨论与结论

堆肥过程是微生物种群生态系统发生复杂变化的过程，借助高通量测序研究堆肥过程中微生物群落的演替规律，极大地便利了研究者对微生物菌群分类情况的研究。蔡涵冰等[12]发现在细菌属水平上，随着堆肥的进行，优势菌群从梭菌属和芽孢杆菌演变为杆状杆菌属、芽孢杆菌属和拟杆菌属，环境因子对细菌和真菌群落结构影响相关性排序均为pH＞铵态氮＞温度＞TOC＞TN，其中pH对微生物群落组成影响最大。卫亚红等[13]分析家畜粪便好氧堆肥中微生物类群变化规律，发现堆肥过程中细菌是优势种群，对发酵升温影响较大，芽孢杆菌是优势种属。上述研究结果与本试验高通量测序结果一致，均表明芽孢杆菌具有堆肥潜力。

通过对近十年白花前胡研究文献进行分析，发现前期对白花前胡的研究领域较广，主要学科包括中药学、农作物、生物学、药学、农艺学、化学、园艺、植物保护、肿瘤学、林业、一般化学工业、农业基础科学等，在研究方向上重点集中在化学成分和药理作用等方面，但有关白花前胡的种质资源分析评价、优良品种培育等方面的研究报道较少，对目前生产中普遍存在的早期抽薹现象关注度不够。建议后期加强对白花前胡的种质资源收集与评价、科学合理的留种技术研究、优质种子生产技术体系的建立等方面研究的关注与重视，解决制约生产发展的瓶颈技术问题，切实促进白花前胡种植产业的发展。

畜禽粪便富含分子结构坚固的纤维素，自然条件下通常需要微生物分泌一系列的酶协同才能将之降解为可利用的糖类。筛纤维素降解能力强的菌株和制备微生物菌剂是加快堆肥效率的重要手段[14]。本试验以畜禽粪便中大量存在的纤维素作为指标，从鸡粪堆肥中成功筛选出3株分解纤维素的优势菌株，D1解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、D5苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）和D7地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

优化其产纤维素酶条件，使制备的菌剂具有加速堆肥的效果。环境温度影响细菌蛋白质和酶的合成与活性、RNA的结构稳定性和转录，由此影响菌体的生理活动[15]。常温环境中耐热菌产纤维素酶的最适温度45～65 ℃[16]，本试验筛选出的3株菌培养最适温度41 ℃左右，推测热环境中筛选到的菌产生的酶蛋白耐热性比较高。pH值会影响菌体的细胞原生质膜的电荷，相对中性的环境更容易维持菌体内环境的稳态[17]。本试验中菌株在pH值偏中性的环境中产酶较高一致。培养基所用碳源是影响细菌分泌蛋白的影响因子之一，优质的碳源能提供细菌生理生化反应的骨架，还能提升细菌产酶的效率[18]。本试验选用麦芽糖和葡萄糖作为碳源，碳源对菌株产酶影响显著，进一步论证了优质碳源对细菌的生长和产酶有积极的作用，能为菌体细胞架构和营养生长提供更多碳素来源。氮源是微生物生长不可或缺的重要因素，可以为菌体的生长提供能量[19]，本试验结果证明酵母提取物能对试验细菌纤维素酶活性具有明显的提升效果。

此外延长保存时间，降低保存条件是微生物堆肥技术创新和提高产量的关键[20]。玉米芯内部的多孔结构易于溶液渗透，菌液吸附性强。玉米芯表面官能团可以与重金属离子发生化学或物理吸附现象，这也有助于一定程度上减轻堆肥中普遍存在的有效态重金属污染。同时有相关报道玉米芯粉作为培养基成分对芽孢杆菌有产酶活性的提升作用，比可溶性淀粉、麦芽糖和葡萄糖等添加物对菌株产酶效果更好[21]。

中国进入新时代，中国酒业正在进入承上启下的变革时代。当前人们日益增长的美好生活需要更加广泛和多元化，也要求白酒产业链上的每一个环节都要充分了解消费者的新需求、新变化，把握消费新趋势，并对市场做出积极应对。

本试验通过比较几种不同的菌剂载体，发现玉米芯粉作为菌剂载体具有良好的贮菌能力。接种外源优势微生物，优化菌株的最佳培养条件和最佳载体，制备复合固化菌剂，更有利于加速堆肥进程，缩短发酵周期和提高堆肥质量，从而缓解畜禽排泄物造成的环境污染，为无害化处理养殖业粪便污染的实用性研究提供数据基础。