浊点萃取响应面优化山楂总黄酮提取工艺

孟庆华,张光辉

(陕西中医药大学 ,陕西 咸阳 712046)

山楂为蔷薇科植物山里红、山楂或野山楂的干燥成熟果实，主产于山东、河北、河南、辽宁、江苏[1]。现代化学研究表明，山楂中含山楂酸、黄酮类、内酯、糖类、甙类、蛋白质及钙、磷、铁等人体必需元素[2～3]。山楂具有消食健胃，行气散瘀之功效[4]。山楂黄酮提取目前多为醇提法，郭艳华[5]等考察了浸提时间、温度、料液比、酸度等对提取山楂中总黄酮含量的影响；王珊珊[6]等通过单因素试验与响应面模型设计分析不同乙醇浓度、提取温度、超声时间和料液比对山楂总黄酮提取率的影响；刘煊崴[7]等采用索式提取法，通过单因素及正交试验考察了甲醇浓度、提取时间以及料液比对提取效果的影响。浊点萃取是利用浊点原理与表面活性剂的增溶作用对待分离组分进行富集的一种新型的液-液萃取技术，李凯龙[10]等通过浊点富集萃取方法对蔬菜中天然维生素K、同系物叶绿醌(PK)和四烯甲萘醌(MK-4)，并通过液相色谱-串联三重四级杆质谱法对其进行了检测；陈邈[11]等通过浊点萃取-高效液相色谱法对化妆品中4种合成酚类抗氧化剂进行了检测。药用山楂主要有炒山楂、焦山楂、山楂炭和生山楂几种，炮制方法不同，功效有所差异。本项目采用浊点萃取法，考察山楂炮制方法对山楂黄酮含量的影响。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UV1780紫外分光光度计(日本岛津)；Avanti JXN-30/26高效离心机(美国贝克曼库尔公司)；超声波清洗机XC-400(济宁鑫欣超声电子设备有限公司)；恒温水浴锅(上海一凯仪器设备有限公司)。

1.2 试剂

芦丁对照品(批号100800-201506，中国药品生物制品检定所)；化学试剂(AR，南京化学试剂股份有限公司)；山楂药材购于陕西西安地区，由陕西中医药大学鉴定教研室王继涛老师鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 浊点萃取山楂中总黄酮

将山楂烘干去籽粉碎，过60目筛，精密称取山楂粉20.0 g置于烧杯，向其中加入200 mL聚氧乙烯脂肪醇醚(Genapol-X80)，搅拌均匀，400 W超声30 min后，800转离心5 min，取上清液加NaCl溶液适量混均匀，60 ℃水浴30 min，800转离心10 min至溶液清晰分为两层，分液漏斗分离去下层水相，上层有机层中加入20 mL乙醇降低黏度，用超滤膜过滤，回收聚氧乙烯脂肪醇醚，滤液旋转蒸干，得山楂黄酮提取物。

2.2 山楂黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线绘制 精密称取0.0100 g芦丁标准品，加无水乙醇溶解定容至100 mL，配制成浓度为0.10 mg·mL-1的芦丁标准溶液。取6个10 mL容量瓶分别编号，精密移取芦丁标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL分别注入1～6号容量瓶，再分别加入0.30 mL 5%亚硝酸钠、0.30 mL 10%硝酸铝，摇匀静置5 min充分反应后，滴加2.00 mL 4%氢氧化钠[16]，用无水乙醇定容至10 mL，得到不同浓度的标准溶液。以1号为空白，于507 nm处测定吸光度(A)[17]。以吸光度A为纵坐标，浓度C(mg·mL-1)为横坐标，绘制回归曲线，回归方程为A=9.277C+0.0026，r=0.9986，证明芦丁标准品在0.01～0.05 mg·mL-1范围内线性良好。

2.2.2 山楂黄酮含量测定 精密称取山楂提取物0.1000 g，加无水乙醇溶解定容至100 mL，0.45 μm滤膜过滤待测。准确移取滤液2.00 mL，按照2.2.1方法显色，得供试品溶液，在507 nm波长处测定其吸光度，依据回归方程计算黄酮含量。

2.2.3 方法学考察 精密度试验: 取同一芦丁标准溶液，于507 nm处测定吸光度，平行6次，结果平均吸光度为0.264，RSD为0.47%( n =6)，说明仪器精密度良好。

稳定性试验: 取一份供试品溶液，于507 nm处测定吸光度，然后放置2、4、6、8、10 h分别测定吸光度，平均值0.374，RSD为0.83%(n=6)，说明供试品溶液在10 h内稳定。

重复性试验:取山楂提取物0.1000 g 5份，按照2.2.2方法处理并测定吸光度，计算黄酮含量，黄酮平均含量26.13 mg·g-1，RSD为1.02%(n=5)，说明方法重复性良好。

回收率试验: 取已知含量山楂提取物，加入芦丁标准品适量，按照供试品溶液制备方法制备测定吸光度，计算回收率。结果回收率平均值为100.2%，RSD为1.02%(n=5)，说明该方法回收率良好。

2.3 山楂黄酮提取工艺优化

山楂黄酮提取采用浊点萃取法，通过单因素实验筛选，考察液固比(A)、萃取时间(B)、盐溶液离子强度(C)、聚氧乙烯脂肪醇醚浓度(D)对提取率的影响，通过单因素实验，设计4因素3水平表，见表1。利用Design expert 8.0软件试验设计及结果见表2。以山楂黄酮提取率为响应值，使用Design expert 8.0对结果进行多元回归分析，结果见表3。

表1 浊点萃取4因素3水平

表2 响应面试验设计与结果

表3 响应面回归分析的结果

由响应面分析可知，回归方程为：Y=2.62+0.27A+0.18B+0.0.18C+0.073D+0.0657AB+0.045AC-0.055AD-0.028BC+0.058CD-0.28A2-0.23B2-0.16C2-0.13D2。回归模型P=0.0001<0.01，差异有统计学意义，四个因素对山楂黄酮提取率影响大小为：考察液固比>萃取时间>盐溶液离子强度>聚氧乙烯脂肪醇醚浓度，AB交互效应最显著,BC交互最弱。

图2 液固比与萃取时间对提取率的影响

图3 液固比与萃取时间对提取率的影响

图4 液固比与萃取时间对提取率的影响

图5 液固比与萃取时间对提取率的影响

图6 液固比与萃取时间对提取率的影响

通过Design expert 8.0的处理，得到各因素对提取率的响应面图，结果如图1～6所示。预测山楂黄酮的最佳提取工艺为：液料比 87.32∶1，萃取时间30.68 min，盐溶液离子强度3.45 mol·L-1、聚氧乙烯脂肪醇醚浓度34.2 g·L-1，提取率为2.72%。

2.4 最佳工艺验证

根据响应面软件Design expert8.0预测的最佳提取工艺，为了便于实际实验，将预测工艺修正为液料比 90∶1、萃取时间30 min、盐溶液离子强度3.50 mol·L-1、聚氧乙烯脂肪醇醚浓度35 g·L-1进行试验，结果山楂黄酮提取率为2.66%，与预测值2.72%接近。

2.5 不同炮制方法对山楂黄酮含量影响

取炒山楂、焦山楂、山楂炭和生山楂烘干去籽粉碎，按照2.1和2.2方法处理计算黄酮含量，结果见表4。

表4 不同炮制山楂黄酮含量比较

3 讨论

浊点萃取是利用浊点原理和表面活性剂的增溶作用对待分离组分进行富集的一种新型萃取技术，利用表面活性剂在水相中形成胶束可以增加待分离组分溶解度，继而改变实验参数引发相分离，达到对待测组分分离的目的。笔者实验通过浊点萃取法提取山楂黄酮，通过响应面软件Design expert8.0优化，提取工艺最终提取率达为2.66%，并且发现，调节离子强度或者改变表面活性剂浓度等均可以提高提取率。浊点萃取法由于不使用有机溶剂，具有绿色环保，成本低廉的特点，有可能成为未来中药有效成分提取的绿色新工艺。