适宜药渣栽培的灵芝优良菌株筛选与鉴定*

张 鑫，谢 苗，亓小妮，郭雅琳，刘养山，张 景，杜秀菊

（聊城大学生命科学学院，山东 聊城 252000）

灵芝是中药之宝，素有“仙草”之美誉。最早关于灵芝的记载是《神农本草经》，其中评价灵芝为“上上之药，方中妙品”[1]，现代药理学和临床实践进一步证实了灵芝的药理作用，并证实了多糖和三萜是灵芝的主要活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、保肝护肝、降血糖、治疗神经衰弱等药理作用，可以强身健体，延年益寿[2]。目前，灵芝常以生药材、药用制剂、保健品饮品等商品面向市场[3]。

我国药渣年产量每年高达3.4×107t，大多作为废弃物堆放、填埋或焚烧[4]，造成了严重的环境污染和资源浪费。研究表明，药渣保留了粗纤维和粗脂肪等有效成分，是培养药用真菌的优良原料[5]。

为找出适合中药渣培养的灵芝品种，对9种来源不同的灵芝菌株进行了菌种长势观察和出芝试验，基于ITS基因序列同源性关系建立系统发育树并鉴定其亲缘关系[6]。为合理开发中药渣剩余价值变废为宝提供理论依据，对灵芝产业的代料栽培拓展空间。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株来源

9种灵芝菌株名称及来源见下表1。

表1 供试菌株编号及其来源Tab.1 Numbers and sources of tested strains

如表1所示，9种灵芝菌株中，7种菌株购于武汉周玉麟食用菌研究所，其他2种灵芝菌株（LD-202023.2和LD-202083.8） 为聊城大学微生物学实验室从灵芝组织中分离获得，其子实体来源于山东冠县灵芝栽培基地，冠县是全国最大灵芝栽培基地，但冠县灵芝长期存在量多价低的现象。

1.1.2 培养基

菌种活化培养基CPDA：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g，补足纯水至1 000 mL，pH自然。

菌种扩繁培养基CYPDA：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、药渣200 g，纯水补足至1 000 mL，pH自然。

菌丝体培养液体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、药渣200 g，纯水补足至1 000 mL，pH自然。

二级药渣栽培料配方：中药渣60%、麦麸38%、石膏1%、葡萄糖1%、磷酸二氢钾0.4%，料液比约为 1∶1.1～1∶1.3。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化及扩繁

在无菌环境下，从9株灵芝菌种的CPDA试管培养基中，挑取菌丝浓、白、健壮的小块菌丝体接入到CYPDA扩繁平板培养基，27℃培养箱中暗培养5 d～7 d。

1.2.2 灵芝菌株的平板菌丝长势

用打孔器从每块扩繁平板中均匀选取相同数量、大小相等的纯化菌丝体接入到新的CYPDA平板培养基中，每个平板接种1块。每日测量菌块直径大小，观察其形态、色泽、密度、边缘整齐程度[7]，计算菌丝的日生长速率，每个菌株设置3次平行试验。

1.2.3 液体培养基中菌丝长势

1.2.1中的CYPDA培养基培养5 d～7 d后，选取2块直径1 cm的圆形菌块，接入到150 mL液体培养基。接种后的液体培养基于摇床25℃、150 r·min-1恒温避光培养1周，观察菌丝球形态、颜色、大小、密度、培养基颜色及生物量等指标[8]。

1.2.4 瓶式栽培培养基中菌丝长势

通过一级培养（1.2.2和1.2.3）观察菌丝在固体培养基和液体培养基中的长势，筛选出长势较好的灵芝菌种进行瓶栽二级培养。观察菌丝在二级药渣栽培料中适应程度及生长特征，进一步筛选出药渣适栽培优良灵芝菌种。

1.2.5 菌丝体DNA提取及凝胶电泳检测

DNA的提取参照童森淼等[9]和张杰等[10]的方法，并略有改进。选取形态大小适宜的菌丝球，用无菌水清洗后离心去沉淀，-80℃冷冻过夜用于提取DNA[11]。冷冻的菌丝体经高通量组织研磨器研磨，使用CTAB法提取DNA，苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1） 去除蛋白，异丙醇沉淀DNA，酒精洗涤，在TE缓冲液中溶解并保存。1.0%的琼脂糖凝胶，50×TAE为电泳缓冲液，上样量为1 μL，121 V电压电泳35 min，检测DNA样品纯度[12]。

1.2.6 ITS-PCR扩增及序列测定

采用真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1和ITS4（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC） 进行PCR扩增[13]。引物由金唯智生物科技有限公司合成，扩增在Bio-Rad T100 PCR仪上进行。

采用25 μL反应体系：2×Taq mix（东盛生物科技有限公司） 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL，下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，总体积25 μL。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。

PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在UVP凝胶成像系统下成像保存。PCR扩增产物由金唯智生物科技有限公司进行单向测序。测得的序列用BioEdit软件处理后提交至GenBank[14]。

1.2.7 ITS序列分析

测得的序列根据GenBank上已有的灵芝菌株序列运用Blast对获得的同源序列进行对比分析。通过对9个样品的ITS序列对比，用BioEdit对构树进行编辑[15]，再用Muscle进行多次序列排列，最后用MEGA X构建系统发育树：按照N.J.（Neighbor-joining） 邻接法，以猴头菌属（Hericium） 为外群，经Bootstrap重复构建循环1 000次，来检验所构建进化树的可靠性。

2 结果分析

2.1 试验灵芝菌株的菌丝长势

采用Duncan新复极差法[16]，得到9个灵芝菌株在相同CYPDA药渣培养基中的生长状况，详见表2。

表2 9种灵芝菌株的平板菌丝长势Tab.2 mycelial growth of nine Ganoderma lucidum strains on plate

如表2所示，韩芝1（LD-202023.2） 生长速度最快，可达（2.19±0.35） cm·d-1；其次是大红芝 （LD-202033.3） 和紫芝 （LD-202083.8） 生长速度较快，分别达到 （1.85±0.23） cm·d-1和（1.81±0.26） cm·d-1；美芝 （LD-202053.5） 和韩芝 （LD-202013.1） 生长速度较慢，分别为（0.71±0.12） cm·d-1和 （0.72±0.20） cm·d-1。

2.2 液体培养基菌种长势

在25℃、150 r·min-1恒温避光摇床的相同培养条件下，9种灵芝菌株在液体培养基中的生长状况见表3。

表3 9种灵芝菌株液体培养长势Tab.3 Growth of nine Ganoderma lucidum strains with liquid cultivation

如表3所示，韩芝（LD-202013.1）、泰山灵芝（LD-202043.4）、鹿角灵芝 （LD-202063.6） 和 G10（LD-202093.9） 的菌丝球为刺状；大红芝（LD-202033.3） 和紫芝 （LD-202083.8） 的菌丝球为梭状；美芝 （LD-202053.5） 和黑芝 （LD-202073.7）的菌丝球为圆球状；韩芝1（LD-202023.2） 的菌丝球为颗粒状。韩芝1（LD-202023.2）、大红芝（LD-202033.3） 和紫芝（LD-202083.8） 的菌丝球数量较多且生长较快，且除韩芝 （202013.1） 和美芝（202053.5）以外，其他菌株的菌丝球大小都均匀。

2.3 瓶式栽培培养基中菌丝长势

结合平板培养和液体培养菌丝生长情况，挑选了韩芝1（LD-202023.2）、大红芝（LD-202033.3）、泰山（LD-202043.4）、黑芝（LD-202073.7）、紫芝（LD-202083.8） 5个菌种进行瓶式栽培，培养菌丝生长状况见表4。

表4 瓶式栽培培养基中5种灵芝菌种的菌丝长势Tab.4 Mycelial growth of five Ganoderma lucidum strains in bottle culture medium

如表4所示，在药渣培养基中，大红芝、韩芝、紫芝3个菌株的菌丝生长速度较快且菌丝最为粗壮、浓密、纯白。黑芝和泰山灵芝，生长速度较慢，菌丝长势一般。菌株的菌丝长势强弱可以作为评价灵芝菌株优劣的重要指标[17]，综合各项指标，大红芝、韩芝、紫芝3个菌株更适合于药渣培养基进行栽培。

2.4 子实体形态及生物学效率比较

一级、二级培养优良菌株中，选择韩芝1（LD-202023.2）、紫芝（LD-202083.8） 2种长势较好的灵芝菌株进行三级栽培管理，采用直径10 cm、长30 cm的高密度聚乙烯菌袋。其菌盖生长情况和生物学效率见表5。

表5 子实体形态及生物学效率Tab.5 Fruit body morphology and biological efficiency

如表5所示，紫芝（LD-202083.8） 和韩芝1（LD-202023.2）的生物学效率均达到30%以上。

2.5 DNA电泳图分析

9个灵芝ITS-PCR电泳图见图1。

图1 供试灵芝菌种ITS-PCR电泳图Fig.1 ITS-PCR electrophoresis of tested Ganoderma lucidum strains

如图1所示，9个灵芝菌株样品均有较为清晰的扩增条带，菌株的ITS-PCR序列的片段在750 bp左右，在长度上具有比较好的保守性，表明此特异引物具有较强的特异性，适用于灵芝菌种的分子鉴定[18]。

2.6 系统发育树分析

测序结果登录NCBI经Blast比对。韩芝1（LD-202023.2） 与 NR 164049.1（G.sandunense） 的期待值（E值）为0，有效序列长度高达97%，相似度为95.95%；大红芝 （LD-202033.3） 与 NR 132919.1（G.desttructans） 的期待值为0，有效序列长度高达100%，相似度为94.77%；紫芝（LD-202083.8） 与NR 132919.1（G.desttructans） 的期待值为0，有效序列长度高达100%，相似度为94.86%，确定这三个菌株均为Ganoderma的不同株系。选取相似度高的前7个序列，基于ITS基因使用邻近法所构建的系统发育树见图2。

由图2可以看出，菌株韩芝（LD-202013） 与NR 152892.1（G.sichuanense）、泰山灵芝 （LD-202043.4）、美芝（LD-202053.5）、鹿角灵芝（LD-202063.6）、G10（LD-202093.9） 等菌株的 ITS序列同源性较高，序列一致为99.26%；黑芝（LD-2020273.7） 与 NR 164048.1 （G.nasalanense） 菌株的同源性较高，序列一致性为94.21%；紫芝（LD-202083.8） 与韩芝1（LD-202023.2）、大红芝（LD-202033.3）的菌株的同源性较高。

图2 基于ITS的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS

系统发育树结果显示，韩芝（LD-202013.1）、泰山灵芝 （LD-202043.4）、美芝 （LD-202053.5）、鹿角灵芝 （LD-202063.6）、G10（LD-202093.9） 与NR 164435.1（G.meredithae） 聚为一支，与 NR 152892.1（G.sichuanense）的遗传距离最小，亲缘关系最近；黑芝（LD-2020273.7） 与NR 158431.1（G.angustisporum） 聚为一支，与NR 164048.1（G.nasalanense）的遗传距离最小，亲缘关系最近[19]；菌株紫芝（LD-202083.8）与韩芝1（LD-202023.2）、大红芝（LD-202033.3）聚为一支且遗传距离最小，亲缘关系最近。

3 结论与讨论

经过一级、二级、三级菌种的药渣栽培试验，以9个菌株的菌丝长势和灵芝子实体性状为主要依据进行筛选。结果表明，韩芝1（LD-202023.2）、大红芝（LD-202033.3） 和紫芝（LD-202083.8） 更适合药渣栽培。

已有的研究表明，灵芝属ITS序列的种间序列相似性低于94%，种内相似性高于98%[20]。通过对9种灵芝菌株的ITS序列与NCBI中检索的7种相似序列进行系统发育树分析，表明韩芝（LD-202013.1）、黑芝 （LD-2020273.7） 分别与 NR 164435.1（G.meredithae）、NR 132919.1 （G.destructans） 相似度高达100%，应属于同一种；紫芝（LD-202083.8） 与韩芝1（LD-202023.2）、大红芝（LD-202033.3） 相似度高达99%，应属于同一种[21]。

适合药渣栽培的3个菌株：韩芝1（LD-202023.2）、大红芝 （LD-202033.3） 和紫芝 （LD-202083.8），韩芝1菌丝长势最强，为药渣栽培的最佳菌株。得到最佳菌株，即可充分利用药渣的剩余价值，变废为宝，有望能够完全或部分替代木糖醇渣或棉籽壳等传统主料，节约成本、提高投入产出比，有助于乡村振兴，促进生态文明建设。