灵芝三萜通过Wnt信号通路对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响*

王炳清， 马庆波， 刘敬博， 高俊波

(北大医疗鲁中医院 神经外科， 山东 淄博 255400)

胶质瘤是一种常见的原发性颅内肿瘤，发病后患者表现出恶心呕吐、头痛、视觉模糊、癫痫等症状，严重时出现视觉丧失、肢体疼痛或麻木、肌力弱、运动与感觉障碍，临床多给予患者手术联合放化疗，该病很难根治，术后复发率也较高[1-2]，预后不佳，因此探讨其发生、发展的相关分子生物学机制和基因表达调节规律对于改善患者预后有着重要的意义[3-4]。Wnt/β连环蛋白信号通路(Wnt/β-catenin)是生物进化中调控细胞增殖、生长和凋亡的重要通路，其异常激活与肿瘤的发生和发展均密切相关[5]，推测干预该通路可帮助治疗胶质瘤[6]。头痛、头风、真头痛、厥逆等症状，中医认为属于外感六邪或内伤七情而致机体气血阴阳失衡，郁结于脑内所致[7-8]；而中药材灵芝性温、味甘，具有补中益气、扶正固本、滋补强壮的功效[9]，因此本文选取灵芝的主要成分之一灵芝三萜作用于人胶质瘤细胞株U251细胞，观察对细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡的影响，分析灵芝三萜通过Wnt信号通路对胶质瘤细胞侵袭和迁移的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库内购入人胶质瘤细胞株U251。

1.1.2主要仪器及试剂 (dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco，DMEM)培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜及Transwell小室购自美国Thermo Fisher公司，灵芝三萜(99%纯度)购自杭州甫洛生物科技有限公司，Wnt/β-catenin通路的检测试剂盒及相关试剂购自美国Sigma公司，兔抗人β-catenin多克隆体、兔抗人p-GSK-3β多克隆体购自英国Abcam公司；流式细胞仪购自美国BD公司，CO2培养箱购自日本SANYO公司，HBS-1096B酶标仪购自南京德铁试验设备公司。

1.2 方法

1.2.1分组及细胞培养 本研究将U251细胞分为4组：空白对照组未进行药物处理，低、中、高剂量组分别给予10、50 及100 mg/L的灵芝三萜处理。将人胶质瘤U251细胞复苏后接种于DMEM培养基内，内含10%FBS，于37 ℃、5%CO2培养箱内培养，每2 d更换培养液1次，细胞密度达85%时使用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期期U251细胞接种至6孔板内，密度为1×109个/L，37 ℃培养箱内过夜，细胞贴壁后，采用10、50 及100 mg/L的灵芝三萜及等量的PBS分别处理U251细胞，置37 ℃培养箱内培养。

1.2.2CCK8实验检测细胞增殖 设置3个复孔，于药物处理后培养24、48及72 h时，加入10 μL CCK8试剂，37 ℃培养4 h。使用酶标仪读取波长490 nm处的吸光度(OD值)，取平均值，该OD值代表细胞的增殖能力。

1.2.3Transwell实验检测细胞侵袭 药物处理后各组U251细胞均使用胰酶消化，使用改良Eagle培养基(DMEM)培养液悬浮并调整细胞浓度为1×108个/L，Transwell小室上室加100 μL细胞悬液，将下室内加入DMEM培养液(含10%FBS)500 μL，设置3个平行复孔，37 ℃培养箱内放置24 h。取出小室，PBS洗涤2次，多聚甲醛(4%)固定30 min，1%结晶染色10 min，PBS洗涤并晾干，随机选取3个视野在显微镜下观察并统计细胞侵袭数，实验重复3次，取平均值进行计算。

1.2.4划痕实验检测细胞迁移 药物处理后的贴壁细胞以每孔1×106个细胞在6孔板内接种，置于37 ℃培养箱内，细胞贴壁单层生长时，使用无菌移液枪对6孔板表面垂直直线划痕，PBS洗去脱落细胞，更换培养液培养48 h，每组均设置3个复孔，使用显微镜观察划痕距离并计算细胞迁移率，实验重复3次，取平均值进行计算。

1.2.5流式细胞仪技术检测细胞凋亡率 将药物处理后5×105个对数生长期的U251细胞接种在75 mL的培养瓶内，加入10 mL F12培养液，干预24 h后，收集悬液及贴壁细胞，加入Annexin V-FITC488和PI溶液，室温下避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测3次，取平均值。

1.2.6Western blot检测β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达 取1.2.1中的细胞提取蛋白，加适量放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液冰上裂解细胞(30 min)，置于4 ℃环境中以12 000 r/min离心30 min，吸取上清液。取等量总蛋白上样，12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(dodecyl sulfate,sodium salt -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳，直至电泳道胶的底端，转膜，无蛋白快速封闭液封闭20 min，加一抗(1 ∶10 000)、二抗(1 ∶10 000)，以β-actin为内参，使用Image J软件分析蛋白表达情况，实验重复3次，取平均值进行计算。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对细胞增殖的影响

结果显示，药物作用各时点，对照组的OD值高于各灵芝三萜组，差异有统计学意义(P<0.05)；随着灵芝三萜浓度的升高药物作用各时点的OD值均逐渐降低，但随着作用时间的延长不同浓度灵芝三萜各组的OD值均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 灵芝三萜对U251细胞增殖的影响

2.2 对细胞侵袭的影响

结果显示，药物作用各时点，对照组的侵袭细胞数均多于各灵芝三萜组，差异有统计学意义(P<0.05)；灵芝三萜作用24、48及72 h时,随着灵芝三萜浓度的升高侵袭细胞数均逐渐减少，但随着作用时间的延长、不同浓度灵芝三萜转染下的侵袭细胞数均增多，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 灵芝三萜对U251细胞侵袭的影响

2.3 对细胞迁移的影响

结果显示，药物作用各时点，对照组的细胞迁移率均高于各灵芝三萜组，差异有统计学意义(P<0.05)；随着灵芝三萜浓度的升高各作用时点的细胞迁移率均逐渐降低，但随着作用时间的延长不同浓度灵芝三萜转染下的迁移率均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 灵芝三萜对U251细胞迁移率的影响

2.4 对细胞凋亡的影响

结果显示，对照组细胞各时点的凋亡率均高于各灵芝三萜组，差异有统计学意义(P<0.05)；随着灵芝三萜浓度的升高各作用时点的细胞凋亡率均逐渐降低，但随着作用时间的延长不同浓度灵芝三萜转染下的凋亡率均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 灵芝三萜对U251细胞凋亡的影响

2.5 β-catenin蛋白表达的变化

结果显示，对照组药物各作用时间的β-catenin蛋白表达均高于各灵芝三萜组，差异有统计学意义(P<0.05)；随着灵芝三萜浓度的升高各作用时点的β-catenin蛋白表达均逐渐升高，但随着作用时间的延长不同浓度灵芝三萜转染下的β-catenin蛋白表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表5。

表5 灵芝三萜对U251中β-catenin蛋白表达的影响

图1 各组人胶质瘤细胞株U251中β-catenin蛋白表达(Western blot)

2.6 p-GSK-3β蛋白表达的变化

结果显示，对照组药物作用各时间点的p-GSK-3β蛋白表达均高于各灵芝三萜组，差异有统计学意义(P<0.05)；随着灵芝三萜浓度的升高各作用时点的p-GSK-3β蛋白表达均逐渐升高，但随着作用时间的延长不同浓度灵芝三萜转染下的p-GSK-3β蛋白表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表6。

表6 灵芝三萜对U251中p-GSK-3β蛋白表达的影响

图2 各组人胶质瘤细胞株U251中p-GSK-3β蛋白表达(Western blot)

3 讨论

临床中已有较多研究证实Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤的发生和发展中均有重要作用，β-catenin在细胞核、细胞膜、细胞质内均存在，是Wnt信号通路中的关键信号枢纽[10]。正常状态下机体内的Wnt信号通路未激活，细胞质内的β-catenin与GSK-3β相结合，随之被相应受体磷酸化，并经泛素酶降解，因此正常状态下胞质β-catenin水平始终较低。而当Wnt信号通路被异常激活时，β-catenin蛋白则因无法被降解而大量聚集在胞质内，并迁移至细胞核中，形成转录复合物，促使该通路下游靶基因转录，导致细胞生长[11-13]。因此当Wnt信号通路受到外界刺激异常激活时，β-catenin发生突变会造成细胞周期异常变化，细胞增殖失控，凋亡过程抑制，诱发肿瘤[14]。而肿瘤发生的实质则是癌细胞的持续分裂和增殖，因此通过调控Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡，对于改善癌症患者预后有重要意义[15]。

近年来中西医结合治疗胶质瘤取得了一定的进展，其中灵芝作为珍贵的中药材也广泛用于对癌症患者的临床治疗中，作为抗肿瘤辅助药物，灵芝不仅能够增强机体的免疫力，对人体的毒副作用也较小[16-17]。但随着各项研究的不断深入，虽有研究已经明确灵芝对癌症患者具有一定的治疗作用，但尚未明确灵芝在癌症治疗中的具体作用机制，尚未清楚其是通过哪一个方面发挥的作用[18]。考虑到Wnt/β-catenin信号通路对癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等过程的影响[19]，本研究选取灵芝的主要成分之一灵芝三萜作用于人胶质瘤细胞株U251细胞，观察不同剂量和不同作用时间U251细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡的变化，分析灵芝三萜通过Wnt信号通路对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响，以期能为今后临床治疗提供指导。

灵芝三萜具有降血脂、降血糖、抗肿瘤、增强免疫力等作用，是灵芝提取物的主要活性成分，已知其在细胞的增殖、钙信号转导和氧化应激等生物过程中均有重要作用[20-21]。本文结果显示，使用灵芝三萜培养的人胶质瘤U251细胞株增殖、侵袭和迁移能力减弱，凋亡率升高，随着灵芝三萜浓度的升高，这种作用愈发明显，且该作用与Wnt/β-catenin信号通路相关。既往研究中发现含羟基的灵芝三萜物质灵芝酸A、H、F能够对乳腺癌细胞的生长和侵袭产生抑制，这与本研究的结果相似。分析灵芝三萜的具体作用机制，发现灵芝三萜能够对机体的免疫系统产生作用，进而影响中性粒细胞释放炎症介质，进而阻止了Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，对肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡过程产生了影响[22]。同时灵芝三萜提高了机体的免疫活性，促进了T淋巴细胞活化，增强了化疗药物的作用效果，增强药物对肿瘤细胞的杀伤力，达到了较佳的临床效果[23]。

β-catenin蛋白是与细胞骨架相互作用的多功能蛋白，可促进细胞分裂基因的启动；GSK-3β可调控糖原合成酶活性，介导信号蛋白结构蛋白和转录因子转录，可调节细胞的增殖、分化、存活和凋亡[24]。β-catenin、p-GSK-3β蛋白均为Wnt信号通路中的重要因子，本文中在灵芝三萜的作用下β-catenin、p-GSK-3β蛋白表达明显降低，说明灵芝三萜对Wnt信号通路产生了影响，进而对肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡过程产生了影响。

综上所述，灵芝三萜能够通过Wnt信号通路抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡。