HPLC法同时测定痔瘘洗液中大黄素和大黄酚的含量

蒙丽斌， 潘洪平

痔瘘洗液由红花、山银花、大黄、桃仁、花椒、当归、苦参、虎杖、黄柏、地榆炭、白芷和芒硝(配比为2∶3∶3∶1.5∶1.5∶2∶3∶3∶3∶3∶3∶1.5)共十二味中药经加工制成[1]，处方中的大黄具有利湿退黄、泻热通便、解毒消痈之功，为骏猛之品当为君药，与臣药黄柏、山银花、苦参、地榆炭、白芷(辅助君药大黄加强清热解毒、活血止痛、收敛生肌之功)，佐药红花、桃仁、花椒、当归、虎杖(协助君、臣药以加强治疗作用)，使药芒硝(引经调和药)，共奏清热解毒、活血止痛、收敛生肌之功效。药理研究表明，痔瘘洗液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、甲型链球菌、乙型链球菌等细菌均有抑制作用[2]。本品临床主要用于痔疮术后坐浴[3]、痔瘘病[4]和肛门水肿[5]等治疗。由于大黄素和大黄酚为痔瘘洗液的重要抗菌活性成分，因此，测定大黄素和大黄酚的含量对痔瘘洗液的质量控制显得尤为重要。根据大黄素和大黄酚的分子结构特点，本研究采用高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)法同时测定痔瘘洗液中大黄素和大黄酚的含量，为建立该制剂的质量控制方法和质量评价提供依据。

1 材料与方法

1.1仪器与试药 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；CP225D型电子天平(德国赛多利斯公司)；AW-120型电子天平(西班牙COBOS公司)。大黄素、大黄酚对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为110756-200110、110796-200615。规格：大黄素含量为98.7%，20 mg/支；大黄酚含量为99.2%，20 mg/支)。痔瘘洗液(上海凯宝药业股份有限公司，批号：20101214、20100711、20100121，均在药品有效期内完成试验)。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为超纯水。

1.2方法

1.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。柱温25 ℃。进样量：供试品、对照品各10 μl。流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20，V/V)。检测波长选择254 nm。流速为0.8 ml/min。

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1 对照品溶液的配制 分别精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，加入无水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液制成每1 ml含大黄素10 μg、大黄酚25 μg的混合对照品溶液，作为对照品储备液。

1.2.2.2 供试品溶液的配制 精密量取供试品30 ml，加盐酸3 ml，加热回流30 min，立即冷却，用三氯甲烷提取3次，每次30 ml合并三氯甲烷液，蒸干，残渣用甲醇使溶解，转移至10 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，制得供试品溶液。该法制备的供试品溶液所得的峰形、出峰时间及分离都可达到较好效果。

1.2.2.3 阴性样品溶液配制 取不含大黄的阴性样品，采用供试品溶液制备方法(“1.2.2.2”项下)制备阴性样品溶液，进样分析。

1.2.2.4 线性关系考察 分别取“1.2.2.1”项下的大黄素和大黄酚对照品溶液，加甲醇制成每1 μl含大黄素0.16 μg、大黄酚0.79 μg的混合对照品溶液，作为系列浓度的对照品溶液。依次自动进样5、10、15、20、25 μl，记录色谱图。以对照品进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归分析。

1.2.2.5 精密度考察 分别精密吸取“1.2.2.1”项下的大黄素和大黄酚混合对照品溶液10 μl，在相同的色谱条件下连续进样6次，分别测定峰面积的积分值。分别计算大黄素、大黄酚峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，于室温下0、2、4、6、8、12、24 h分别按上述色谱条件测定，分别测定大黄素、大黄酚的峰面积积分值，分别计算大黄素、大黄酚峰面积的RSD。

1.2.2.7 重复性试验 取同一批样品(批号：20100711)共6份，按供试品溶液制备方法平行制备溶液并测定大黄素、大黄酚的平均含量及其相应的RSD。

1.2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的样品(批号：20100711)10 ml，分别精密加入一定量的大黄素、大黄酚对照品，按“1.2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下的色谱条件测定，计算加样回收率。

1.2.2.9 样品含量测定 取3批痔瘘洗液样品，按“1.2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下的色谱条件测定，计算样品的大黄素、大黄酚含量。

2 结果

2.1色谱条件与系统适用性试验结果 结果表明，大黄素和大黄酚，及其与杂质峰分离良好，分离度>1.5，所得峰形尖，对称，重复性好，无拖尾现象，理论塔板数符合要求，说明色谱柱柱效高，同时无阴性干扰，出峰时间亦达到满意的效果。结果提示色谱条件选择恰当，系统适用性试验良好。见图1。

ⓐ对照品；ⓑ供试品；ⓒ阴性样品(15.728-大黄素；21.171-大黄酚)

2.2线性关系考察结果 以对照品进样量X(μg)(为横坐标)，对峰面积Y(为纵坐标)进行线性回归分析，结果表明，各组分在表1浓度范围内的线性关系良好。见表1。

表1 大黄素和大黄酚的线性与范围

2.3精密度考察结果 大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.35%、0.12%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4稳定性试验结果 室温下0～24 h内，大黄素、大黄酚的RSD分别为1.52%、0.44%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.5重复性试验结果 同一批样品的大黄素、大黄酚的平均含量分别为4.83 μg/ml、9.29 μg/ml，RSD分别为0.84%、0.61%(n=6)，表明分析方法重复性良好。

2.6加样回收率试验结果 已知含量的样品的加样回收率试验结果提示，大黄素、大黄酚的平均回收率分别为98.80%、102.50%，RSD分别为0.19%、0.02%。见表2。

表2 加样回收率试验测定结果

2.7样品含量测定结果 3批痔瘘洗液样品的大黄素、大黄酚含量测定结果见表3。

表3 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1大黄素与大黄酚具有相似的分子结构，两者极性相近，传统的化学分析方法可将大黄素与大黄酚混合物(如总蒽醌)的乙醚液，依次用碳酸钠、氢氧化钠水溶液萃取，分别得到大黄素、大黄酚；或利用聚酰胺柱层析法，以稀醇至高浓度醇洗脱，依次得到大黄素、大黄酚。但这些方法具有步骤繁琐、操作复杂、准确度差、回收率低、精密度和重复性不高、分析结果慢等缺点，均不适宜作为制剂的质量控制方法。HPLC法以液体为流动相，将不同极性的混合物溶于溶剂中，通过高压输液系统，泵入装有固定相的色谱柱中，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测。HPLC法具有高压、高速(分析速度快)、高效(分离效能高)、高灵敏度、操作简便、重现性好和应用范围广等特点。已有一些文献报道通过HPLC法同时测定大黄素、大黄酚等成分的含量，对口服中成药[6-7]、外用中成药[8-11]、中药材[12-13]甚至一些民族药[14]进行有效质量控制。由于大黄是痔瘘洗液的重要药味，而大黄素和大黄酚则是大黄的主要有效成分。目前已见一些关于痔瘘洗液质量标准研究的报道：杨家福等[15]采用薄层色谱法鉴别痔瘘洗液中的大黄、黄柏；陈展[16]采用加速试验和长期试验方法,考察痔瘘洗液在不同试验条件下样品的性状、鉴别、含量及微生物的变化,并对痔瘘洗液进行了质量稳定性考察,以评价该药品质量；陈展和凌晓云[17]还建立了痔瘘洗液微生物限度检查方法；陈展和吴晓燕[18]采用HPLC法对山银花中的绿原酸进行了含量测定以建立痔瘘洗液的质量控制方法。本研究采用HPLC法同时测定痔瘘洗液中主要抗菌活性成分大黄素和大黄酚的含量，具备一定的难度和较好的药理针对性，其方法及实验过程可重复性较好，进一步拓宽痔瘘洗液的质量标准研究，为建立该制剂精准的质量控制方法和提高质量评价标准提供依据，具备一定的创新性和指导意义。

3.2从本研究结果概括出以下几点体会。(1)大黄素、大黄酚提取条件的确定。在对痔瘘洗液中大黄素和大黄酚进行提取的预实验中，曾试用5%～30%盐酸进行酸化处理，结果表明利用10%盐酸酸化后提取效果最佳。在对加热回流时间(5～60 min)进行考察时确定加热回流30 min为最佳时间。在对甲醇、乙醇、三氯甲烷等溶剂进行考察时，确定三氯甲烷提取3次较为完全且易于挥发蒸干溶剂。(2)大黄素、大黄酚检测波长的确定。根据大黄素和大黄酚均具有共轭双键结构的特点，以及凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物在特定吸收波长处所测得的吸收度可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定的原理[19]，各取大黄素、大黄酚对照品的甲醇溶液，经可见紫外分光光度计，在220～470 nm波长的范围内进行扫描，结果大黄素和大黄酚的最大吸收波长分别是253.9 nm和255.1 nm。借鉴其他含大黄成分的中成药进行大黄素和大黄酚含量同时测定以监控产品质量的方法[20]，以及笔者对含大黄成分的中成药痔瘘洗液样品的实际测定结果，本研究确定大黄素、大黄酚同时测定的检测波长为254 nm。(3)流动相和柱温的确定。一般用于分离大黄素和大黄酚的流动相主要有甲醇-0.1%磷酸水溶液(70∶30)、甲醇-0.1%磷酸水溶液(85∶15)和甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)。对以上的流动相，采用柱温25℃，流速0.8 ml/min，逐一系统进行试验，结果发现甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)为流动相时，对痔瘘洗液中大黄素、大黄酚及其相邻峰分离良好，分离度>1.5，同时所得到的峰形尖，对称，重复性好，不拖尾，理论塔板数符合要求，柱效高，同时无阴性干扰，出峰时间亦达到满意的效果。(4)进样量的考察。分别对进样量为5 μl、10 μl、20 μl的对照品和样品进行考察，结果发现，在峰的响应值满足的前提下，综合考虑峰形、峰高、RSD值、杂质干扰和色谱柱寿命等情况，决定10 μl为较为理想的进样量。(5)色谱条件的确定。通过优选，本研究确定HPLC法同时测定痔瘘洗液中大黄素和大黄酚含量的色谱条件：柱温25 ℃，流速0.8 ml/min，流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)。

总之，利用上述色谱条件以HPLC法同时测定痔瘘洗液中的大黄素、大黄酚含量时，大黄素、大黄酚与其他干扰成分得到较好的分离。该法具有操作简单、准确、回收率好、精密度和重复性高、分析快速等优点，可用来连续测定痔瘘洗液中的大黄素、大黄酚含量，同时该色谱条件下阴性样品溶液不产生干扰，提示该方法适合作为痔瘘洗液的质量控制方法。