酰化胶原溶液的流变行为研究*

2021-10-13李从虎龙槿彦胡佳慧李国英李文娟

功能材料 2021年9期

李从虎，龙槿彦，吴彦，胡佳慧，李国英，李文娟

(1.四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，成都 610065；2.安庆师范大学生命科学学院，安徽安庆 246133)

0 引言

胶原是一种天然大分子产物，广泛存在于动物的皮肤、软骨等结缔组织中，因具有良好的生物相容性、细胞吸附性和低免疫原性等优良特性而广泛应用于食品、生物医药和组织工程等领域[1]。受到剪切力的作用，将胶原溶液制备成凝胶、海绵、膜、纤维等产品时，其粘弹性、抗变性能等理化特性会发生改变，最终影响到胶原产品的性质和外观[2]。由于流变学可以准确地反映蛋白质等天然大分子在生产和加工过程中受外力作用而发生的形变，因此，对胶原溶液的流变性能进行系统的研究，揭示其内部结构与力学响应之间的规律，对获得稳定的胶原产品具有十分重要的意义。

近年来，对胶原及其衍生物的流变行为的研究已有一定的报道。Ding等将羧甲基纤维素钠引入到胶原溶液(8 mg/mL)中，其流动性能显著提升[3]。Yang等人发现幂律方程、Carreau模型可有效拟合胶原溶液的稳态流动曲线[4]。Chen等考察了己二酸-NHS酯(NHS-AA)对碱溶胶原溶液的流变性能，结果表明随着NHS-AA浓度的升高到1.5 mmol/L时，溶液的弹性模量、粘性模量和复数粘度不断增大；随后，随着NHS-AA浓度的继续升高，溶液弹性模量、粘性模量和复数粘度反而下降[5]。作为一种蛋白质，胶原溶液的流动性能对温度十分敏感。段炼等研究了温度对胶原溶液的稳态流变性能的影响，发现胶原溶液具有明显的假塑性，温度升高剪切粘度却下降[6]。

然而天然胶原难以在中性条件下溶解，且表面活性较低，限制了其应用。若天然胶原能够自身形成胶束等表面活性剂缔合体系，则可将亲脂药物包裹在聚集体内，不仅对药物起到增溶、保护和稳定作用，还对控制药物的缓释具有重要的意义。因此，作者在胶原的侧链引入了疏水的月桂酰残基和亲水的琥珀酰残基，制备得到一种具有两亲结构的酰化胶原，其结构示意图如图1所示[7]。酰化胶原不仅保持了天然胶原的生物活性，还提升了表面性质[8-9]。在酰化胶原溶液的存储、生产和应用时，其流动性能必然会受到温度的影响。因此，本文主要研究了酰化胶原溶液的稳态剪切粘度、动态频率扫描、蠕变以及触变行为，并对其流动曲线进行了数学模拟，以期为该产品的生产和应用提供理论依据。

图1 酰化胶原示意图[7]Fig 1 Structural scheme of acylated collagen[7]

1 实验

1.1 实验仪器

流变仪：MarsⅢ型，德国Haake公司。

1.2 酰化胶原水溶液的制备

按照文献[7]制备酰化胶原，将酰化胶原海绵溶解于0.01 mol/L的PBS(pH7.4)中，制备得到7.5 mg/mL的酰化胶原溶液，在4 ℃下保存备用。

1.3 稳态流变测试

采用流变仪和锥板模式(外锥角为1°，直径为35 mm，板间距为0.053 mm)，选用粘度法模式，在控制速率的条件下测试酰化胶原溶液的稳态流变性能，其中温度范围分别为25、27.5和30 ℃，剪切速率γ范围为0.01～100 s-1。

1.4 动态流变测试

采用流变仪和锥板模式(外锥角为1°，直径为35 mm，板间距为0.053 mm)，并在动态测试中选择应力控制模式下，研究酰化胶原溶液的粘弹性行为，测定弹性模量(G′)、粘性模量(G″)、复数粘度(η*)和内耗(tanδ)随着频率的变化。测试温度分别为25、27.5和30 ℃，应变为5%，动态频率0.01～10 Hz。

1.5 蠕变测试

将制备的酰化胶原溶液置于流变仪的锥-板夹具中(外锥角为1°，直径为35 mm，板间距为0.053 mm)。分别在25、27.5和30 ℃下，对其施加1 Pa的应力并持续100 s，记录其蠕变状况。随后，在接下来的400 s里去除样品上施加的应力，使其慢慢回复，记录其回复状况。

1.6 触变测试

分别在25、27.5和30 ℃条件下，将制备的酰化胶原溶液置于流变仪的锥-板夹具中(外锥角为1°，直径为35 mm，板间距为0.053 mm)。设置剪切速率在150 s内从0.01 s-1增大到50 s-1，然后剪切速率在接下来的150 s内从50 s-1降低到0.01 s-1。

1.7 数学模拟

采用幂率方程、Carreau和Cross方程对不同温度的酰化胶原溶液的稳态剪切曲线进行拟合[10-11]；采用Leonov模型对酰化胶原溶液的动态频率曲线进行拟合[12]；采用Burger模型对蠕变曲线进行拟合[13]；采用Herschel-Bulkley方程对触变测试曲线进行拟合[14]。

其中，

幂率方程：

η=Kγn-1

(1)

式(1)为幂率方程的关系式，其中η是剪切粘度(Pa·s)，γ是剪切速率(s-1)，K是粘度指数，n为材料的非牛顿指数。

Carreau方程：

(η-η∞)/(η0-η∞)=[1+(λγ)2](q-1)/2

(2)

式(2)中，η是剪切粘度(Pa·s)，η0为零剪切粘度(Pa·s)，η∞为无穷剪切粘度(Pa·s)，γ是剪切速率(s-1)，n为材料的非牛顿指数，λ为体系常数。

Cross方程：

(3)

式(3)中，η是剪切粘度(Pa·s)，η0为零剪切粘度(Pa·s)，η∞为无穷剪切粘度(Pa·s)，α为特征弛豫时间(s)，m为材料常数。

Leonov方程：

(4)

(5)

式(4)和(5)中，Ωk=ωθk,θk代表在第k次松弛模型的松弛时间，ω和m0分别代表频率和材料常数。

Burger方程：

γ(t)=σ0t/η0+σ0/G0+σ(1-e-t/λ/G1)

(6)

式(6)中，G0和G1都表示弹性系数，但G0反映酰化胶原溶液在应力作用下抗形变的能力，而G1主要是阻止粘性原件的变形；σ0和η0分别代表应力和产生不可回复残留变形的粘性系数；λ是回复的延迟时间。

Herschel-Bulkley方程：

τ=τ0+βγa

(7)

式(7)中，τ0是屈服应力，β和a分别是材料参数和幂指数。

2 结果与讨论

2.1 稳态流变测试

图2揭示了酰化胶原溶液在25、27.5和30 ℃条件下的稳态剪切曲线。由图可知，随着温度的升高，酰化胶原溶液的剪切粘度呈现降低的趋势。这是因为随着温度的升高，酰化胶原分子的无规则热运动增大，其聚集体逐渐松散，使得粘度逐渐下降[6]。从图中还可以看出，在测试温度范围内，酰化胶原溶液的粘度都随剪切速率的增加而减小，表现为剪切变稀行为[15]。这是因为剪切力增大，酰化胶原分子之间的相互作用力减弱，使得溶液的流动性逐渐增加[4]。

图2 酰化胶原溶液剪切粘度和剪切速率的关系Fig 2 Relationship between the viscosity (η)and the shear rate of acylated collagen solutions

表1所示为采用幂律方程拟合酰化胶原溶液的稳态流变测试曲线参数。由表可知，拟合的相关系数R2均接近于1.0，表明该模型拟合效果较好。不同温度条件下，n值小于1，表明酰化胶原溶液具有假塑性。随着温度的升高，n值不断上升但K值逐渐下降，表明酰化胶原溶液的假塑性和粘度随温度的升高而不断降低。拟合结果与实际测试结果相似，这是因为温度升高，分子运动加快，分子之间的摩擦力和聚集体的缠结力不断降低，导致酰化胶原的假塑性和粘度出现降低的趋势。

表1 酰化胶原溶液在不同温度下幂率方程拟合得到的参数Table 1 Parameters from Power law model fitting ofacylated collagen solutions at different temperatures

表2和3所示为酰化胶原溶液在不同温度下Carreau和Cross方程拟合得到的参数。由表可知，用Carreau和Cross方程拟合得到的相关系数R2都接近于1，表明Carreau和Cross方程都能够准确的描述酰化胶原溶液的剪切流动。Carreau与Cross方程中预测的零剪切粘度都是随着温度的上升而减小，说明温度升高酰化胶原溶液的假塑性越弱，与稳态剪切的实验结果相符合。然而无穷剪切粘度非常小，这是因为当剪切速率非常高时，酰化胶原聚集体已经解聚成单分子，溶液的流动已经非常不稳定，甚至被破坏，导致无穷剪切粘度非常小[16]。

表2 酰化胶原溶液在不同温度下Carreau方程拟合得到的参数Table 2 Parameters from Carreau model fitting of acylated collagen solutions at different temperatures

表3 酰化胶原溶液在不同温度下Cross方程拟合得到的参数Table 3 Parameters from Cross model fitting ofacylated collagen solutions at different temperatures

2.2 动态流变测试

在动态频率测试中，弹性模量(G′)和粘性模量(G″)可以提供材料在液—固间响应的结构特性的重要信息[10]。图3所示为酰化胶原溶液在不同温度条件下的动态模量曲线。在所测试的温度下，酰化胶原溶液均具有末端区和高弹区。G′和G″随着温度的升高而降低，但随着频率的上升而呈逐渐增大。在低频下(G′G″)，酰化胶原溶液以弹性行为为主。随着温度的上升，交叉点(G′=G″)频率也逐渐从0.037 Hz升高到0.160 Hz，表明在酰化胶原分子的松弛速率随温度的升高而加快，即松弛时间随温度升高而缩短。当温度升高时，相邻分子链CO和NH之间的氢键被破坏[17]，酰化胶原分子的热运动能量增加，体系中分子之间的自由体积增大，使链段跃迁速度加快，并且形成的聚集体减小。

图3 不同温度下酰化胶原溶液的动态模量曲线Fig 3 Dynamic modulus of acylated collagen solutions at different temperatures

图4所示为不同温度下酰化胶原溶液的复数粘度和损耗因子曲线。由图可知，酰化胶原溶液的复数粘度随温度的升高而降低，随频率的增加而降低。这一趋势与稳态剪切测试中酰化胶原溶液发生的剪切变稀是一致的。温度的升高使分子之间的变换加快并减少分子之间的吸引力。然而在溶液体系中，分子之间的吸引力比分子之间的变换要强得多，因此粘度会随温度的升高而降低[18]。损耗因子(tanδ)是指G″与G′的比值(tanδ=G″/G′)。因此，当tanδ>1时，高分子溶液中的G″大于G′，所以该体系为粘性特征占优势；当tanδ<1时，高分子溶液中的G″小于G′，所以该体系为弹性特征占优势[19]。酰化胶原溶液的tanδ随着温度的升高而上升，表明酰化胶原溶液的粘性特征随着温度的升高而越来越强，这是因为温度上升，酰化胶原溶液的流动性更强。

图4 不同温度下酰化胶原溶液复数粘度(a)和损耗因子(b)Fig 4 Complex viscosity and loss factor of acylated collagen solution under different temperatures

表4为酰化胶原溶液在不同温度条件下采用Lenovo方程进行动态频率测试拟合得到的参数。可见，Lenovo模型对酰化胶原溶液的动态频率曲线具有较好的拟合效果(R2≈1.0)。随着温度的升高，ηk值不断降低，表明酰化胶原溶液的粘度随温度升高而呈降低趋势。拟合结果与实验结果相符，这是因为温度的升高，使分子间的相互作用力减弱，分子运动能力增强，导致酰化胶原溶液的流动性升高。

表4 酰化胶原溶液在不同温度下Leonov方程拟合得到的参数Table 4 Parameters from theLeonov model fitting of the acylated collagen solutions at different temperatures

2.3 蠕变测试

图5是对酰化胶原溶液在不同温度条件下施加1 Pa的应力所测得的蠕变曲线。从图中可以看出，酰化胶原溶液在所测试的温度范围内都表现出典型的蠕变行为，都具有可回复应变和不可回复应变。因此，在所测试温度范围内，酰化胶原溶液依然具有普弹形变、高弹形变和粘性流动响应，并表现出明显的粘弹性。通常，柔量越大表明材料抵抗变形的能力越弱[20]。对酰化胶原溶液施加1 Pa的应力持续100 s后，柔量随温度的升高而逐渐降低，表明酰化胶原溶液在低温下具有较强的抵抗变形的能力。这是因为随着温度的升高，酰化胶原分子的热运动增加，聚集体减小，使其更容易发生形变，最终导致其抵抗形变的能力变弱。当外力去除后，随着温度的升高，酰化胶原溶液均出现回复现象，其回复部分占最大柔量的比值从31%降低到26%，表明酰化胶原溶液发生形变后所能回复的应变越小，在应力作用下发生粘性流动所占的比例也越大。

图5 不同温度下酰化胶原溶液的蠕变测试曲线Fig 5 Creep curves of acylated collagen solutions at different temperatures

图6为酰化胶原溶液在不同温度条件通过Burger模型对蠕变阶段的拟合示意图。结果发现Burger模型可以有效描述酰化胶原溶液抵抗变形的能力。通过模型可以预测，随着温度的升高，由于分子间的相互作用力减弱，导致酰化胶原溶液的弹性响应和抵抗变形的能力逐渐降低。

图6 Burger模型对酰化胶原溶液在不同温度条件下蠕变曲线的拟合Fig 6 Creep curves of acylated collagen solutions simulated by the Burger model at different temperatures

2.4 触变测试

图7是酰化胶原溶液在不同温度条件下的触变环曲线。由图可见，触变环面积未见明显改变，可能是因为所测试温度范围较小。然而，在50 s-1的剪切速率下，其剪应力由52 Pa降低到41 Pa，表明酰化胶原溶液的粘度随温度升高而降低。随着剪切速率的增加，酰化胶原分子缠结形成的网络结构被破坏。当剪切速率逐渐降低时，酰化胶原分子结构逐渐回复。由于这种回复程度小于分子结构的破坏速率，导致酰化胶原触变曲线的上行线和下行线不重叠[21]。

图7 酰化胶原溶液在不同温度下的触变环曲线Fig 7 Thixotropic loop of acylated collagen solutions at different temperatures

图8是使用Herschel-Bulkley方程对酰化胶原溶液在25 ℃条件下触变测试的上行线和下行线分别进行的拟合示意图。可以看出，Herschel-Bulkley方程的拟合曲线与实验数据曲线可以较好的重合，且拟合的相关系数R2均接近于1.0。

图8 Herschel-Bulkley方程对酰化胶原溶液触变环曲线的上行线(a)和下行线(b)的拟合(25 ℃)Fig 8 Up curve and down curve of CBS solution (7.5 mg/mL)and simulated curves from Herschel-Bulkley model (25 ℃)