陆英有效部位抗菌活性研究5

邓先清，朱明辉，谢 权，朱洋女，朱明明，宋明霞

（1.井冈山大学医学部，江西，吉安 343009；2.井冈山大学中药资源和功能分子研究中心，江西，吉安 343009）

随着细菌对越来越多的药物产生耐药，多重耐药菌的感染导致越来越高的患者发病率和死亡率，细菌耐药性问题日益威胁人类健康[1]。面对细菌的耐药和新病原菌出现及其导致的严重状况，需要通过不断探索、发现、实验摸索去研制结构新颖、作用机制独特有效的抗菌药物。我国拥有极其丰富的天然药用资源，从中寻找高效低毒的抗菌药物将会是解决细菌耐药问题的有效途径[2-4]。

陆英(Sambucus chinensis Lindl.)是忍冬科植物,又被称作接骨草、八棱麻、走马风等，多年生草本植物，分布于我国大部分地区，资源丰富。陆英始载于《神农本草经》[5]，味甘、酸、性温，以根、茎及叶入药，具有散瘀消肿、祛风活络、去湿止痛等功效[6-7]，在民间，因具有接骨功能而得名接骨草，现广泛用于跌打损伤、骨折疼痛、风湿关节痛等。

陆英针剂可用于治疗急性菌痢、急性化脓性扁桃腺炎、多发性疖肿等炎症，因而具有一定抗菌消炎作用[8]。现代药理研究证实陆英具有抗炎镇痛作用，其根茎叶水提液灌胃给药对急性炎症有明显抑制作用，对物理性和炎性疼痛也具有明显的镇痛作用[9-10]。陆英化学成分主要含三萜类物质，如伊香树脂醇、香树酯醇、齐墩果酸、乌索酸等。近年大量文献报道了三萜酸类成分较强的药理活性，如抗肝炎[11]、降血糖[12]、抗病毒[13]等活性，且陆英作为临床上的常用药，已广泛用于急性病毒性肝炎、消炎等，但目前其抗菌作用有效部位及抗菌物质基础的研究尚未见报道。

本实验拟系统研究陆英提取物的体外抗菌活性，获得其对临床常见普通菌株和耐药菌株的MIC值，并基于陆英的主要成分和物质基础，对其抗菌活性部位进行追踪，获得其有效部位。通过比较不同提取方式对抗菌活性成分的提取优劣，确定陆英抗菌活性成分的有效提取方式，为后续抑菌中药的开发及应用研究奠定基础[14]。

1 材料与方法

1.1 仪器

KXQ-LS 高压灭菌仪（上海博讯有限公司），GRP-9080 隔水式恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司），HZQ-F100 全温振荡培养箱（江苏太仓市华美生化仪器厂），SW-CJ-2D 型双人单面净化工作台（普通型，苏州净化设备有限公司），iMark 酶标仪（美国伯乐公司），旋转蒸发器RE-3000（上海亚荣生化仪器厂），HM-701 超微粉碎机（北京环亚天元机械技术有限公司），SL-250 型超声波清洗器（上海生析超声仪器有限公司），ZNHW 型电热套（上海羌强仪器设备有限公司），WT30001B 电子天平（常州万泰天平仪器有限公司）。

1.2 试剂与材料

陆英采自江西吉安，由井冈山大学医学部周秋贵副教授鉴定；培养基（英国OXOID 公司，500 g makes 38.4 litres），BHI 培养基(英国OXOID 公司，500 g makes 13.5 Litres)，二甲亚砜（国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR 500 mL），G116212 甘油（阿拉丁试剂公司，500 mL)；十三种常见菌：革兰氏阳性军金葡萄球菌CMCC(B) 26003 和CMCC 25923、枯草芽孢杆菌CMCC 63501、粪肠球菌CMCC 29212、变异链球菌BNCC 336931、耐药金葡萄球菌ATCC 33591 和ATCC 43300、革兰氏阴性菌大肠杆菌CMCC 44568 和CMCC 25922、铜绿假单胞菌CMCC 10104 和CMCC 27853 以及耐药铜绿假单胞菌ATCC BAA-2111、大肠杆菌ATCC BAA-196，以上菌种是从中国科学院微生物研究所、北纳生物科技有限公司和美国ATCC 菌种保藏中心采购得到。

1.3 方法

1.3.1 陆英不同溶剂提取物的制备

1.3.1.1 甲醇超声法

将干燥陆英粉碎，称药末50 g，50 ℃下用90%的甲醇（料液比=1:10(m/v)）超声提取1 h，连续3 次，合并3 次提取液减压浓缩成浸膏。称取0.25 g粗提物浸膏于离心管中备用。剩余浸膏按1:10（m/v）溶于水中，再分别用1:20(m/v)的石油醚、乙酸乙酯萃取3 次，合并萃取液，得石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、水相萃取物，浓缩溶剂后得到各相浸膏。

1.3.1.2 乙醇热回流法

称取陆英药粉50 g，用75% 乙醇按料液比1:10(m/v)于圆底烧瓶中加热回流1 h，过滤，滤渣再重复操作2 次，合并3 次滤液，减压浓缩成浸膏。称取0.25 g 的粗提物浸膏于离心管中备用。剩余的浸膏按1:10（m/v）溶于水中，再依次用1:20(m/v)的石油醚、乙酸乙酯萃取3 次，合并萃取液，得石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、水相萃取物，浓缩溶剂后得到各相浸膏[15]。

1.3.2 抗菌实验

1.3.2.1 药液制备

将两种提取方法得到的0.25 g 粗体浸膏和石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、水相萃取物浸膏溶于0.5 mL 二甲基亚砜（DMSO）中，得到浓度为0.5 g/mL 的各部位药液，放在4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2.2 抗菌活性评价

1.3.2.2.1 初筛

将培养至对数期的菌种用培养基稀释成105CFU/mL浓度备用。96 孔培养板中，每孔加入100μL 培养液、4 μL药液和100 μL菌液，使药液最终浓度为10 mg/mL。37℃下, 在培养箱中培养24 h。用酶标仪在650 nm测吸光度, 根据培养前后吸光度的变化最后计算得到抑制率。若化合物抑制率大于75%，则选出进行后续实验。

2 结果与分析

2.1 两种提取方法的提取率比较

如表1 所示，乙醇回流法的提取率要明显高于甲醇超声法，说明温度高低对其药物物质的溶出影响更大，加热更有利药材中各类成分的溶出。从陆英粗提物各萃取相的提取含量中可以看出，萃取后乙酸乙酯萃取相含量都是最少的，水相是最多的，石油醚相居中，且乙醇回流方法得到的各萃取相的成分含量都比甲醇超声法要多。

表1 两种提取方法的提取率比较（%）aTable1 Comparison of extraction rates for two extraction methods(%)

2.2 不同提取方法所得粗提物的抗菌活性

如表2 所示，实验选取了图表中这些常见革兰氏阳性菌、阴性菌和几个耐药菌进行活性测定，两种不同提取方式所得粗提物对大多数所选菌株在10 mg/mL 剂量下表现抗菌活性，但对变异链球菌BNCC 336931 和大肠杆菌CMCC 44568 未表现出抗菌活性。比较两种提取法获得粗提物的活性，发现甲醇超声法提取物对一些菌株的抗菌活性要强于乙醇回流法，前者对金葡菌CMCC 26003、CMCC 25923 和枯草芽孢杆菌CMCC 63501 的活性要比后者高8 倍，对枯草芽孢杆菌CMCC 63501 菌株的抗菌MIC 值达到0.625 mg/mL。

表2 不同提取方法获得粗提物的抑菌活性比较（MIC 值，mg/mL）Table 2 Comparison of antibacterial activity of two crude extracts

2.3 粗提物的三种萃取相抗菌活性比较

通过将两种提取方式所得粗提物依次进行石油醚、乙酸乙酯和水萃取，分别得到石油醚相、乙酸乙相和水相。如表3 所示，石油醚萃取相对常见革兰氏阳性菌都具有不同程度的抑菌活性；乙酸乙酯和水相对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌也表现出较好的抗菌活性，但对粪肠球菌CMCC 29212和变异链球菌BNCC 336931 的抗菌活性较弱。从不同菌株的敏感性来看，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌对陆英有效成分更为敏感。从两种提取方法来比较，甲醇法的萃取物抗菌活性都比乙醇法的萃取物更好，尤其是前者，其石油醚萃取相对金葡菌CMCC 26003 和枯草芽孢杆菌CMCC 63501 的MIC值达到了0.625 mg/ml。因此甲醇提取的石油醚相是阳性菌有效成分的活性部位。

表3 各萃取相对革兰氏阳性菌的MIC 值(mg/mL)Table 3 Antibacterial activity of different crude extracts against Gram-positive bacteria

表4 为各萃取相对常见阴性菌的抑菌活性结果。两种提取方法的水相在10 mg/mL 浓度下都未见抗菌活性，甲醇提取法的石油醚相和乙酸乙酯相对各种阴性菌均有活性，MIC 值大多为10 mg/mL。乙醇提取法的石油醚相比乙酸乙酯相要好，前者对大肠杆菌CMCC 44568、CMCC 25922 和铜绿假单胞菌CMCC 27853 在10 mg/mL 浓度下表现出活性，而后者仅对大肠杆菌25922 表现出抗菌活性。

表4 各萃取相对革兰氏阴性菌的MIC 值(mg/mL)Table 4 Antibacterial activity of different extracts of two crude extracts against resistant bacteria

表5 为各萃取相对几个耐药菌的抑菌活性结果。两种提取方法的水相萃取物只对耐药金黄色葡萄球菌ATCC 43300 显示出抗菌活性（MIC=5.0 mg/mL），对另外几种耐药菌则在10 mg/mL 浓度下未表现抑菌活性。而石油醚和乙酸乙酯萃相则对各耐药菌株都显现出了良好的抑制活性。其中，耐药性金黄色葡萄球菌对陆英活性成分更为敏感，甲醇超声法的石油醚相的对耐药金黄色葡萄球菌ATCC 33591 和43300 的MIC 分别达到1.25、0.625 mg/mL。此外，乙醇提取法的石油醚相对ATCC 33591 的MIC 也达到1.25 mg/mL，表现较强抗菌活性。萃取物对于耐药性革兰氏阴性菌活性弱一些，石油醚相和乙酸乙酯相的抑菌MIC 在5～10 mg/mL。

表5 各萃取相对耐药菌的抗菌活性MIC 值(mg/mL)Table 5 Antibacterial activity of different extracts of two crude extracts against resistant bacteria

3 小结

陆英作为一种临床常见的中草药，在疏肝健脾、活血散瘀方面具有广泛应用。其抗肝炎的突出作用尤为引人关注，而其在抗菌等方面的药效物质基础研究还处在起步阶段。本研究通过探究陆英对不同菌株的抗菌活性，以及其提取方法和抗菌有效部位，不仅促进了陆英的全面开发，也拓宽了中草药抗菌的研究途径。我们实验发现陆英对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都表现出很好的抑制活性，尤其对前者抑制活性更强。从提取方法而言，陆英乙醇回流提取能够获得更多的提取物，但该提取物的抗菌活性要低于甲醇超声提取法得到的提取物，两者对金葡菌的活性相差8 倍。说明甲醇超声更有利于抗菌活性成分的溶出。通过比较不同萃取部位的抗菌活性，确定了石油醚相作为陆英的抗菌活性部位，说明抗菌有效成分大多分布在该相。这一点与已报道的大多数抗菌中草药不同。大多数植物的抗菌活性来源于黄酮类化合物，后者的极性较大，易被乙醚或者乙酸乙酯萃取，而陆英中已报道的绿原酸等抗菌物质同样极性较大，不易被石油醚萃取。本研究发现陆英抗菌活性有效部位是石油醚层，说明该药中可能含有其他未见报道的小极性抗菌化学成分，这对于新的抗菌药物研究具有重要意义，也对陆英抗菌的深入研究叶提供了科学依据。