基于UPLC-Q-Exactive-MS代谢组学技术的蒙药塔布森-2对去势大鼠代谢的调控作用研究

杨 帆，冯文斌，董 馨，马飞祥，陆景坤，薛培凤*

1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110

2.呼伦贝尔市中蒙医院 药剂科，内蒙古 呼伦贝尔 021000

蒙药塔布森-2 又称二味杜仲汤，由杜仲与蒙药蓝刺头配伍而成，记载于经典的蒙医医学著作《蒙医金匮》，是蒙医治疗骨伤的常用方剂，可固骨质、接骨愈伤、清赫依，用于治疗骨折、骨热、赫依症等。应用蒙药二味杜仲汤临床治疗60 例绝经后骨质疏松症患者，总体治愈率达到90%[1]。蒙药二味杜仲汤可通过类雌激素样作用抑制骨吸收，促进骨形成，调节骨吸收与骨形成的耦联，降低骨转换率，减少骨丢失，延缓绝经后骨质疏松症的发生发展过程[2]。

本课题组前期对蒙药塔布森-2 进行了提取工艺、体内药理学、网络药理学、药动学、血清药物化学及血清代谢组学研究[3-4]，发现蒙药塔布森-2能够明显改善去势大鼠骨密度、骨体积/总体积、骨小梁数量、骨小梁分离度等骨微结构参数。采用网络药理学预测了蒙药塔布森-2 与绝经后骨质疏松密切相关的3 个创新性靶点并在血清中进行了机制验证，结果表明蒙药塔布森-2 能够降低血清中维生素D 受体（vitamin D receptor，VDR）、细胞色素P450 19A1（cytochrome p450 19A1，CYP19A1）含量从而发挥抗绝经后骨质疏松的作用。但是仅仅通过药效学、药动学和血清药物化学的研究单一且分散，不能很好地反映蒙药治疗疾病的整体观。而网络药理学虽然具有“多成分、多目标”的整体观念，但只能起到预测的作用。

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后兴起的系统生物学分支，被认为是最新的“组学”科学，可以对来自组织、细胞或生物体液的小分子代谢产物进行全面、系统地分析[5]。代谢物的组成和浓度可能随着疾病的进展而改变，代谢组学有助于筛选与疾病密切相关的潜在生物标志物或靶向治疗途径的基因[6]。因此，本研究从尿液粪便样品入手，采用超高效液相色谱联用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Exactive-ΜS）代谢组学技术研究蒙药塔布森-2 对去势大鼠代谢的调控作用，以期更加全面地阐述蒙药塔布森-2 治疗绝经后骨质疏松的代谢通路。

1 材料

1.1 动物

SPF 级Wistar 雌性大鼠48 只，12 周龄，体质量（220±20）g，购自内蒙古医科大学实验动物研究中心，动物许可证号SCXK（蒙）2015-0001。动物于温度20～23 ℃、相对湿度50%～60%、12 h昼夜交替的环境中适应性饲养7 d，自由进食饮水。动物实验经内蒙古医科大学医学伦理委员会批准（批准号YKD2018056）。

1.2 药材

蒙药蓝刺头药材于2019年8月采自内蒙古呼和浩特市武川县，杜仲药材（批号112987）购自安徽亳州市大禹药业有限公司，经内蒙古医科大学药学院薛培凤教授鉴定分别为菊科植物驴欺口Echinops latifoliusTausch 的干燥花序、杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥树皮。

1.3 药品与试剂

结合性雌激素片（批号20170102，每片含结合雌激素0.625 mg）购自新疆新姿源生物制药公司生产；骨疏康颗粒（批号180108073，10 g/袋）购自辽宁康辰药业；水合氯醛（批号RH122661）购自罗恩试剂；质谱级甲酸、甲醇购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；超纯水经ALH-600-U 净化系统制备。

1.4 仪器

UPLC-Q-Exactive-ΜS（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；BA210 型数码显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；EYELAN-1100 型旋转蒸发器（上海爱郎仪器有限公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；离心机（德国CHRIST 公司）；BCD-290W型电冰箱（青岛海尔股份有限公司）。

2 方法

2.1 蒙药塔布森-2 药液的制备

根据本课题组前期确定的蒙药塔布森-2 的最佳提取工艺进行药液制备，具体操作如下：将方中蓝刺头与杜仲粉碎后过筛制得粗粉，各取250 g，加入10 倍量蒸馏水浸泡30 min，连续加热回流提取2 次，30 min/次。合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥，冻干粉末于4 ℃保存，使用时用适量蒸馏水溶解。该法平均得粉率为25%，蒙药塔布森-2 药液含有效成分京尼平苷酸0.100 mg/g、新绿原酸0.086 mg/g、绿原酸0.587 mg/g、京尼平苷0.021 mg/g、松脂醇二葡萄糖苷0.140 mg/g、异绿原酸A 0.116 mg/g、1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸0.070 mg/g、异绿原酸C 0.042 mg/g、紫云英苷0.025 mg/g。

2.2 造模、分组与给药

大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、结合雌激素组（0.065 mg/kg）、骨疏康颗粒组（105.1 mg/kg）和蒙药塔布森-2 高、中、低剂量（950.0、475.0、237.5 mg/kg，分别相当于临床4、2、1 倍剂量）组，每组6 只。除空白组外，其余各组均进行卵巢摘除术，假手术组只摘除相应位置的部分脂肪团。术后连续3 d 大鼠im 青霉素钠，防止术后感染。手术7 d 后，取空白组和模型组大鼠进行阴道上皮角化实验，每日涂片1 次，连续观察5 d，细胞的形态及染色情况见图1，空白组大鼠表现为动情周期交替出现，模型组大鼠连续5 d 均表现为发情间期，提示造模成功[7]。蒙药塔布森-2 冻干粉溶于0.9%氯化钠溶液，分别配制成质量浓度为29.69、59.38、118.75 mg/mL 的溶液；骨疏康颗粒溶于0.9%氯化钠溶液，分别配制成质量浓度为13.14 mg/mL 的溶液；结合雌激素片溶于0.9%氯化钠溶液，分别配制成质量浓度为8.13 mg/mL 的溶液。手术7 d 后，各给药组ig 相应药物，空白组、假手术组和模型组ig 等体积0.9%氯化钠溶液，1 次/d，连续8 周。大鼠末次给药后，进入代谢笼饲养，期间禁食不禁水，24 h 后收集尿液和粪便，迅速分装后于-80 ℃保存备用。

图1 显微镜下大鼠动情周期阴道涂片Fig.1 Rat estrus cycle vaginal smear under microscope

2.3 UPLC-Q-Exactive-MS 代谢组学分析

2.3.1 尿液、粪便样本的处理 取出冻存尿液，自然解冻，每个尿液样本取200 µL，分别置于干燥的离心管中，加入3 倍量甲醇涡旋3 min，4 ℃、3500 r/min 离心10 min，收集上清液。取出冻存粪便，自然解冻，每个粪便样本取50 mg，加入3 倍量甲醇进行研磨，涡旋5 min，4 ℃、3500 r/min 离心10 min，收集上清液。将所有的上清液于35 ℃减压干燥后加入200 μL 甲醇复溶，涡旋3 min，离心，取上清液，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，转移至自动进样瓶，进行UPLC-Q-Exactive-ΜS 分析。

2.3.2 质控样本的处理 将所有待测尿液或粪便样本按“2.3.1”项下方法处理，得到上清液，各取20 μL，混合成粪便或尿液质控样本，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，转移至自动进样瓶，进行UPLC-QExactive-ΜS 分析。进样时，每走完1 组样本，插入1 针质控样本。

2.3.3 色谱条件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～1.7 min，5%～15% A；1.7～3.0 min，15%～17% A；3.0～3.3 min，17% A；3.3～8.0 min，17%～25% A；8.0～9.7 min，25%～30% A；9.7～10.6 min，30%～35% A；10.6～14.1 min，35%～55% A；14.1～4.6 min，55% A；14.6～15.1 min，55%～100% A；15.1～17.0 min，100% A；17.0～18.1 min，100%～5% A；18.1～20 min，5% A；柱温为35 ℃；体积流量为0.4 mL/min；进样量为5 µL。

2.3.4 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；正离子模式下离子源电压为4 kV，鞘气体积流量为40 L/min；负离子模式下离子源电压为3.2 kV，鞘气体积流量为35 L/min；离子源温度为350 ℃；饱和辅助气体积流量为2 L/min；裂解电压为300 V；雾化气为氮气；数据采集范围m/z100～1100，采用全扫描方式。

2.3.5 多元数据分析及数据处理 原始数据文件通过Discoverer Compound（CD）™ 2.0 软件，进行峰对齐、峰过滤、峰提取和自动积分，最终创建了1个包含相对分子质量、保留时间（tR）、峰面积、mzCloud 等信息的多维峰表。利用SIΜCA-P 14.1软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）以识别每组样品的总体代谢谱。通过正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）对蒙药塔布森-2 中剂量组和模型组的数据进行统计分析，用于降低所获得的多维复杂数据的维度，绘制出反映组间离散程度的得分图。

筛选出变量重要性投影值（VIP，variable importance plot）＞1 且P＜0.05 的离子作为潜在的特征性生物标志物，将潜在的生物标志物与人类代谢组数据库（HΜDB，http://www.hmdb.ca/）和mzCloud（https://www.mzcloud.org/）进行生物标志物的名称和HΜDB 编号等信息的匹配。再利用ΜetaboAnalyst（http://www.metaboanalyst.ca/）分析参与代谢的生物通路和意义。

3 结果

3.1 潜在生物标志物的筛选

3.1.1 尿液样本中潜在生物标志物的筛选 各组大鼠尿液的PCA 得分图见图2，在正负离子模式下，质控样品分布集中，显示出良好的重现性和可靠性；模型组与其他组的数据得到了良好区分，空白组和模型组大鼠样品距离较远，表明造模成功；空白组数据有一些离散，可能是由大鼠的个体差异和进样的时间差异导致的。OPLS-DA 是基于偏最小二乘法的降噪方法，可以消除与变量相关的正交成分，提高模型的准确度和有效性，很好地揭示组间差异，排除潜在混淆的影响与组差异无关的变量[8]。为了进一步探索蒙药塔布森-2 治疗绝经后骨质疏松的尿液潜在生物标志物，将蒙药塔布森-2 中剂量组与模型组进行OPLS-DA 分析，见图3。采用200 次置换检验的方法对模型进行验证，具体拟合参数结果见表1，正离子模式下：模型解释率（R2Y）＝0.998，模型预测率（Q2）＝0.934；负离子模式下：R2Y＝0.995，Q2＝0.896，表明模型未过拟合，具有很好的预测能力及可靠性。模型组与蒙药塔布森-2 中剂量组样本具有很好的区分。结合VIP-plot 分析结果，筛选VIP＞1 且P＜0.05 的离子作为差异性代谢物，最终筛选得到28 个潜在差异生物标志物见表2，其中正离子15 个、负离子13 个。

表1 200 次置换检验后蒙药塔布森-2 中剂量组与模型组大鼠尿液样本的OPLS-DA 模型拟合参数Table 1 OPLS-DA model parameters of urine samples of rats in medium-dose Mongolian medicine Tubson-2 group and model group by 200 permutation tests

表2 蒙药塔布森-2 中剂量组与模型组大鼠尿液样本的潜在差异代谢物Table 2 Potential different metabolites in urine samples of rats in medium-dose Mongolian medicine Tubson-2 group and model group

图2 正离子 (A) 和负离子 (B) 下各组大鼠尿液样本的PCA 得分图Fig.2 PCA score plot of urine samples of rats in each group in positive ion (A) and negative ion (B)

图3 正离子 (A) 和负离子 (B) 下蒙药塔布森-2 中剂量组与模型组大鼠尿液样本的OPLS-DA 得分图Fig.3 OPLS-DA score plot of urine samples of rats in medium-dose Mongolian medicine Tubson-2 group and model group in positive ion (A) and negative ion (B)

3.1.2 粪便样本中潜在生物标志物的筛选 各组大鼠的粪便代谢轮廓PCA 得分图见图4，在正负离子模式下，质控样品均显示出良好的集中趋势，表明本次实验的可靠性。为了筛选粪便样本中蒙药塔布森-2 治疗绝经后骨质疏松的潜在生物标志物，进一步采用有监督的OPLS-DA，可以更好地获取组间差异信息，并对样品的分组进行预测，结果见图5。采用200 次响应排列测试对模型的质量进行研究，模型未过拟合，具有很好的预测能力及可靠性，具体拟合参数见表3，表明模型组与蒙药塔布森-2 中剂量组样本得到了良好的区分。结合VIP-plot 分析结果，筛选VIP＞1 且P＜0.05 的离子作为差异性代谢物，最终筛选得到28 个潜生物标志物见表4，其中正离子19 个、负离子9 个。

表3 200 次置换检验后蒙药塔布森-2 中剂量组与模型组大鼠粪便样本的OPLS-DA 模型拟合参数Table 3 OPLS-DA model parameters of feces samples of rats in medium-dose Mongolian medicine Tubson-2 group and model group by 200 permutation tests

表4 蒙药塔布森-2 中剂量组与模型组大鼠粪便样本的潜在差异代谢物Table 4 Potential different metabolites in feces samples of rats in medium-dose Mongolian medicine Tubson-2 group and model group

图4 正离子 (A) 和负离子 (B) 下各组大鼠粪便样本的PCA 得分图Fig.4 PCA score plot of feces samples of rats in each group in positive ion (A) and negative ion (B)

图5 正离子 (A) 和负离子 (B) 下蒙药塔布森-2 中剂量组与模型组大鼠粪便样本的OPLS-DA 得分图Fig.5 OPLS-DA score plot of feces samples of rats in medium-dose Mongolian medicine Tubson-2 group and model group in positive ion (A) and negative ion (B)

3.2 代谢通路的分析

3.2.1 尿液样本中潜在生物标志物的代谢通路分析 为了进一步探索蒙药塔布森-2 调节去势大鼠尿液潜在生物标志物的代谢通路，将上述分析得到的28 个差异性代谢物导入ΜetaboAnalyst 数据库对鉴定出的差异代谢生物标志物进行代谢通路的富集，将通路影响值＞0.1 的代谢通路作为目标代谢通路。如图6和表5所示，蒙药塔布森-2 主要通过参与组氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸的代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢3 个代谢通路来治疗去势大鼠的绝经后骨质疏松症。

图6 蒙药塔布森-2 调节去势大鼠尿液潜在生物标志物的代谢通路Fig.6 Metabolic pathway of Mongolian medicine Tubson-2 regulated potential biomarkers in urine of ovariectomized rats

表5 蒙药塔布森-2 调节去势大鼠尿液潜在生物标志物的代谢通路分析Table 5 Metabolic pathways analysis of Tubson-2 regulated potential biomarkers in urine of ovariectomized rats

3.2.2 粪便样本中潜在生物标志物的代谢通路分析 为了进一步探索蒙药塔布森-2 调节去势大鼠粪便潜在生物标志物的代谢通路，将上述分析得到的28 个差异性代谢物导入ΜetaboAnalyst 数据库进行代谢通路富集，将通路影响值＞0.1 的代谢通路作为目标代谢通路。如图7和表6所示，蒙药塔布森-2 主要通过参与维生素B6代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、谷氨酰胺和谷氨酸代谢3 个代谢通路来治疗去势大鼠的绝经后骨质疏松症。

表6 蒙药塔布森-2 调节去势大鼠粪便潜在生物标志物的代谢通路分析Table 6 Metabolic pathways analysis of Mongolian medicine Tubson-2 regulated potential biomarkers in feces of ovariectomized rats

图7 蒙药塔布森-2 调节去势大鼠粪便潜在生物标志物的代谢通路Fig.7 Metabolic pathway of Mongolian medicine Tubson-2 regulated potential biomarkers in feces of ovariectomized rats

4 讨论

骨质疏松症是一种由多种原因引起的代谢性骨疾病，随着世界老龄化进程的加速，骨质疏松症的发病率已跃居慢性病第3 位。我国骨质疏松症的总患病率平均为13%[9]。其中最常见的类型为绝经后骨质疏松症，它是一种由雌激素缺少而导致的骨量低下、骨质量受损及骨强度降低的原发性I 型骨质疏松疾病。目前雌激素代替疗法仍然为治疗绝经型骨质疏症的“黄金手段”，但是长期采用此疗法会诱发卵巢疼痛和浸润性乳腺癌[10]。因此寻找安全可靠的抗绝经后骨质疏松药物意义重大。

通过对大鼠的尿液样品、粪便样品的代谢组学分析可知，蒙药塔布森-2 治疗绝经后骨质疏松症与多条代谢通路的紊乱相关，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及牛磺酸和亚牛磺酸的代谢、组氨酸代谢和维生素B6代谢。其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢为尿液、粪便样本中共同存在的代谢通路。天冬氨酸是一种兴奋性神经递质，参与机体内多种代谢过程，通常情况下，机体代谢发生异常均会引起丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢的紊乱。模型组大鼠尿液、粪便样本中天冬氨酸水平均有所升高，而蒙药塔布森-2 能够显著回调天冬氨酸水平，其发生机制和变化的意义尚缺乏文献报道，需要进一步研究。

组氨酸代谢主要通过下调组氨酸及上调尿刊酸水平来干扰组氨酸代谢的紊乱，进而控制去势大鼠的骨质疏松进程，达到治疗绝经后骨质疏松症的作用。组氨酸脱羧基生成组氨，组氨可以间接增加破骨细胞的数量和活性，进而导致骨质疏松症和异常骨组织形态学指标的发生[11]，组氨酸的水平降低能够抑制破骨细胞活性，降低骨质疏松症的发生率。本研究结果显示，经蒙药塔布森-2 治疗后大鼠尿液中组氨酸水平下降，尿刊酸水平上升，进而减轻绝经后骨质疏松的程度。尿刊酸是由L-组氨酸通过组氨酸解氨酶脱氨而来，是组氨酸的下游产物[12]。蒙医理论认为，骨病的治疗原则与赫依盛型肾病相吻合，因此推测尿刊酸可能通过影响肾功能进而影响骨代谢。牛磺酸是牛磺酸与亚牛磺酸代谢通路的关键代谢物，具有抗氧化应激的作用，能够提高超氧化物歧化酶活性、降低丙二醛水平[13]。研究表明，老年大鼠体内雌激素水平下降，导致骨组织中丙二醛水平升高，超氧化物歧化酶活性下降，进而造成骨流失[14]。吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺是维生素B6的3 种存在形式，而吡哆氨5′-磷酸盐、4-吡哆酸是维生素B6的2 种活性存在形式，均是维生素B6代谢途径上的关键代谢产物。饮食中维生素B6的摄入量低或血液中维生素B6的含量低可能是诱导骨质疏松症的重要危险因素[15]。蒙药塔布森-2 干预后，大鼠粪便中吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺、吡哆氨5′-磷酸盐、4-吡哆酸的代谢量发生改变，表明蒙药塔布森-2 调节大鼠机体内的维生素B6代谢进而减轻去势大鼠的骨质疏松程度，与本课题组前期血清代谢组学研究结果一致，丰富了蒙药塔布森-2 通过调节维生素B6代谢紊乱来治疗绝经后骨质疏松症的科学内涵。

通过分析骨疏康颗粒与雌激素组对去势大鼠尿液、粪便样品的潜在生物标志物的代谢通路发现，雌激素通过调节三羧酸循环、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、苯丙氨酸、络氨酸和色氨酸的生物合成和苯丙氨酸代谢来改善去势大鼠的绝经后骨质疏松程度；其中，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及牛磺酸和亚牛磺酸代谢与蒙药塔布森-2 的代谢组学研究结果一致，均调节L-天冬氨酸、牛磺酸含量，调节趋势一致，但对牛磺酸含量的调节强度较蒙药塔布森-2 稍弱。骨疏康通过调节组氨酸代谢、三羧酸循环、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、维生素B6代谢、精氨酸生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢来改善绝经后骨质疏松程度；其中，组氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢及维生素B6代谢与蒙药塔布森-2 的代谢组学研究结果相同，调节趋势一致，强度相近。

综上所述，蒙药塔布森-2 主要通过调节组氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、维生素B6代谢治疗绝经后骨质疏松症。此外，蒙药塔布森-2 在调节牛磺酸和亚牛磺酸代谢紊乱方面优于骨疏康颗粒与雌激素，其他通路上的调节作用差异不大。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突