姜黄中1个新的裂环没药烷型倍半萜成分

郭玉勤，舒洪珍，谯明鸣，彭 成，刘 菲*，熊 亮*

1.成都中医药大学药学院，西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137

2.成都中医药大学，西南特色药材创新药物成分研究所，四川 成都 611137

姜黄Curcuma longaL.，又名宝鼎香、黄姜、毛姜黄等，姜科（Zingiberaceae）姜黄属草本植物，生于海拔800 m 以下的低山、丘陵、平坝。主要分布于我国四川、福建、广西、云南、台湾等地，是著名的川产道地药材[1-2]。姜黄作为传统的药食两用植物，已有5 千多年的应用历史，在许多国家长期被用作草药、香料和膳食补充剂[3-4]，具有破血行气、通经止痛的功效。现代医学常用于治疗痛经、月经不调、动脉粥样硬化、高脂血症、高血压、糖尿病等疾病[5-6]。化学研究表明，姜黄中主要含姜黄素类、萜类以及其他成分，其中萜类又以倍半萜类成分为代表。目前，从姜黄中鉴定的倍半萜类化合物多达100 多个，结构类型主要包括没药烷型、愈创木烷型、吉玛烷型、桉叶烷型、长松针烷型、杜松烷型、檀香烷型、榄香烷型、蒈烷型、苍耳烷型、菖蒲烷型、柏木烷型等[7-11]，其中没药烷型倍半萜含量最为丰富。课题组前期分离鉴定了多个倍半萜并发现这些成分具有显著的舒张血管活性[12-14]，为了进一步研究姜黄的化学成分及其活性，本研究运用多种色谱和波谱技术分离纯化姜黄中的倍半萜类成分，得到1 个新的裂环没药烷型倍半萜成分，命名为姜黄烷G（curcumane G，1）。对分离得到的化合物进行舒张血管活性评价，结果显示化合物1 无显著舒张血管作用。

1 材料

1.1 仪器与试剂

Bruker-700 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）；Agilent 6230 LC/TOF 高分辨质谱仪（美国Agilent 公司）；安东帕ΜCP 200 旋光仪（美国安东帕有限公司）；圆二色谱仪（英国Chirascan-plus CD光谱仪）；红外光谱仪（美国Agilent 公司）；Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；中压液相色谱仪（瑞士Búchi Gradient Former B-687）；旋转蒸发仪（亚荣生化仪器）；Zorbax SB-C18（250 mm×9.4 mm，5 μm）色谱柱（美国Agilent 公司）；薄层色谱硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；柱色谱硅胶（200～300 目，青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20（瑞典Amershan Pharmacia 公司）；电子天平（德国Sartorius BP221S）；离体组织器官恒温灌流系统（澳大利亚PL3508B6/C-V Panlab 8 Chamber Organ Bath System）；可调式移液器（美国 Thermo Fisher Scinentific）；甲醇（色谱级，美国Tedia 公司）；乙醇（色谱级，美国Fisher 公司）；其他所用试剂均为分析纯（成都市科隆化学品有限公司）。

1.2 实验动物

SD 大鼠，清洁级，雄鼠，体质量（200±20）g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供。动物生产许可证号：SCXK（川）2020-030，检疫后用。饲养温度21～27 ℃，湿度（50±5）%，昼夜光照及通风环境自然调节。动物实验经成都中医药大学实验动物伦理委员会审核（备案编号为2020-04），均符合3R 原则。

1.3 药材

姜黄饮片购于四川新荷花中药饮片有限公司，经成都中医药大学药用植物研究室李敏教授鉴定为姜黄Curcuma longaL.的干燥根茎。姜黄饮片标本（CL-20160803）保存于成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所。

2 方法

2.1 提取与分离

姜黄药材饮片（50 kg），加95%乙醇浸泡过夜，加热回流提取3 次，每次8 倍量溶剂，第1 次3 h、第2 次2 h、第3 次1.5 h，合并提取液，50 ℃减压浓缩得半固体流浸膏7 kg。将浸膏混悬于水中，依次以石油醚、醋酸乙酯反复萃取并将萃取液于50 ℃减压浓缩，得石油醚部位2 kg，醋酸乙酯部位3 kg。醋酸乙酯部位经硅胶柱色谱（150 cm×22 cm）分离，石油醚-醋酸乙酯系统（1∶0、7∶3、4∶6、0∶1）洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并组成相似的组分，减压浓缩至稠浸膏，并依次编号为A～F。浸膏B（500 g）经硅胶柱色谱（150 cm×22 cm）分离，用二氯甲烷-醋酸乙酯系统（100∶1→0∶1）梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱法检视，合并相似洗脱组分并减压浓缩，得16 个流分Fr.1～16。Fr.5进一步经中压液相色谱（30 cm×4 cm）分离，以甲醇-水系统（10%→100%）梯度洗脱，得到10 个流分Fr.5-1～5-10。Fr.5-1 经过凝胶色谱柱分离，石油醚-二氯甲烷-甲醇（2∶2∶1）洗脱，得到5 个流分Fr.5-1-1～5-1-5）。Fr.5-1-5 经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（200∶1→1∶1）梯度洗脱，得到5 个流分Fr.5-1-5-1～5-1-5-5。Fr.5-1-5-3 依次经过制备薄层色谱（石油醚-醋酸乙酯2∶3）和反相半制备高效液相色谱（60%甲醇）分离得到化合物1（6 mg，tR＝28 min，1 mL/min）。

2.2 活性测定

2.2.1 溶液的配制 K-H 液（Kreb’-Henseleit solution）配制：NaCl 13.87 g；KCl 0.7 g；KH2PO40.32 g；ΜgSO40.28 g；NaHCO34.2 g；Glucose 3.64 g；EDTA 0.018 g；CaCl20.56 g；加超纯水至2 L，pH值7.4，现配现用。

样品溶液的配制：精密称取化合物1 适量，加二甲基亚砜配制成50 μmol/mL 的母液，备用。

2.2.2 大鼠胸主动脉血管环的制备 颈椎脱臼处死SD 大鼠，取出胸主动脉，置于预冷却的K-H 液中，剔除血管周围的脂肪和结缔组织后，将其剪成4 个3～5 mm 的血管环，分别将血管环固定于4 个装有20 mL K-H 液的浴槽内（恒温37 ℃，持续通95%O2＋5% CO2混合气体），采用离体组织灌流模型和Power Lab 数据分析系统记录离体血管环张力的变化。保持血管环起始张力为1.0 g 的状态下，每15 min 换1 次K-H 液，待血管环平衡60 min 后，用60 mmol/L 的KCl 连续刺激血管环至少2～3 次。每次刺激后，使用K-H 液连续冲洗3 次，每次5 min，待血管环张力恢复至基础状态后，稳定30 min。当连续相同刺激所引起的血管收缩幅度小于10%时，往浴槽内加入60 mmol/L 的KCl 预收缩胸主动脉环，待血管收缩张力达到平台期时，累积加入5 个浓度（0.25、0.75、2.50、7.50、25.00 μmol/L）的样品溶液，观察浓度与舒张效应曲线，比较不同浓度下化合物对KCl（60 mmol/L）预收缩血管环的舒张作用。

3 结构鉴定

化合物1：无色油状液体，易溶于甲醇、丙酮等有机溶剂。[α]25D＋20.6 (c0.06,ΜeOH)。其质谱数据 (＋)-HR-ESI-ΜSm/z:289.141 4 [Μ＋Na]+（计算值C15H22O4Na,289.141 6）,提示该化合物分子式为C15H22O4，不饱和度为5。UV 光谱显示其在238 nm处有最大吸收，且IR 光谱中显示1684 cm-1的吸收带，提示其可能含有α,β 不饱和酮等官能团[15-16]。1H-NΜR（表1）显示该化合物结构中含有1 个烯氢信号 [δH6.16 (1H,brs)]、3 个单峰甲基信号 [δH2.16(3H,s),1.87 (3H,brs),2.10 (3H,brs)]和1 个双峰甲基信号 [δH0.91 (3H,d,J=7.0 Hz)]。13C-NΜR 和DEPT 谱显示该化合物共有15 个碳信号，可归属为4 个甲基碳、3 个亚甲基碳、4 个次甲基碳 [包含1个连氧叔碳 (δC79.5) 和1 个烯碳 (δC124.8)]和5个季碳 [包含2 个酮羰基碳 (δC205.4,199.6)、1 个酯羰基碳 (δC176.3) 以及1 个双键季碳 (δC155.2)]信号。与文献对比发现，化合物1 的核磁数据与已知化合物3,4-seco-bisabol-10-ene-3-one-1,4-olide[17]的数据类似，区别在于化合物1 的C-9 被氧化为羰基 (δC199.6)，因此，推断化合物1 为裂环没药烷型倍半萜。为了进一步确定化合物1 的结构，进行了2D NΜR 实验。HΜBC 谱和1H-1H COSY 谱显示的主要相关信号如图1所示，尤其是在HΜBC谱中，H-7、H2-8、H-10 同时与C-9 (δC199.6) 相关确证了C-9 为羰基，且与双键Δ10(11)共轭，化合物1 的平面结构得以确定。

图1 化合物1 的结构及主要HMBC、1H-1H COSY 和NOESY 信号Fig.1 Structure and key correlations of HMBC,1H-1H COSY and NOESY of compound 1

表1 化合物1 的1H-(700 MHz,acetone-d6) 和13C-NMR数据 (175 MHz,acetone-d6)Table 1 1H-(700 MHz,acetone-d6) and 13C-NMR (175 MHz,acetone-d6) data of compound 1

进一步通过分析NOSEY 谱和比较核磁数据理论值与计算值确定其相对构型。在NOSEY 谱中，H2-2 与H-6 相关说明H-1 与H-6 位于异侧，而Μe-7处于支链上，无法通过NOSEY 实验确定其相对构型，因此，化合物1 的构型存在4 种可能，即(1S,6S,7S)/(1R,6R,7R)和 (1S,6S,7R)/(1R,6R,7S)。为进一步确定其相对构型，分别对(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1和(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 的核磁数据进行计算。计算结果表明(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 和(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 的13C-NΜR 化学位移计算值（y）与实验值（x）的相关系数（R2）差异不大 [R2(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1:0.998 5；(1S,6S,7R)-1/ (1R,6R,7S)-1:0.998 0；图2-A、B]，相比之下DP4+概率分析对于异构体的区分更具优势[18]，基于1H-和13C-NΜR 数据的DP4+概率分析（图2-C）显示(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 明显优于(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1。进一步通过计算ECD 确定化合物1 的绝对构型，使用Conflex 软件对(1S,6S,7R)-1 进行优势构象搜索，得到了11 个构象（Boltzmann distribution≥1%）。利用 Gaussian6.0 软件，根据密度泛函数理论（DFT），采用密度泛函B3LYP 方法在6-31G 基组水平于空气中对所选构象进行优化，再将优化后的构象采用密度泛函ω-B97XD 方法在DGDZVP 基组水平，于IEFPCΜ 模型在乙腈中再次优化，随后，优化的构象于密度泛函CAΜ-B3LYP 方法在DGDZVP 基组水平，于IEFPCΜ 模型在乙腈中计算ECD 图谱[12]。最后，使用SpecDis1.71 软件打开化合物1 上述构象的ECD 图谱，根据每个构象的玻尔兹曼能量分布进行拟合，生成了(1S,6S,7R)-1 和(1R,6R,7S)-1 的计算ECD 谱（σ＝0.3 eV，UV 位移＋13 nm）如图3所示。结果表明，在200～340 nm，理论计算的 (1S,6S,7R)-1 ECD 谱与实测ECD 谱非常吻合。因此，化合物1 的绝对构型确定为 1S,6S,7R，化合物 1 鉴定为(1S,6S,7R)-3,4-裂环没药烷-10-烯-3,9-二酮-1,4-内酯。

图2 (1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 (A) 和 (1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 (B) 在PCM-mPW191/6-331＋G (d,p) 水平上的13C-NMR 化学位移的回归分析及DP4＋概率 (C)Fig.2 Regression analysis of experimental and calculated 13C-NMR chemical shifts of (1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 (A) and (1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 (B) at PCM-mPW1PW91/ 6-311＋G (d,p) level (acetone-d6);and DP4＋probability for (1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 and(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 at PCM-mPW1PW91/6-311＋G (d,p) level (C)

图3 化合物1 的实测ECD 谱和计算ECD 谱Fig.3 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

4 舒张血管活性评价

中医药治疗心血管疾病具有安全性高、稳定性好、疗效显著的优点，主要表现在舒张血管、抗氧化、抗凝血、调血脂、增加血流量和心肌细胞保护等方面。现代药理研究表明，姜黄具有舒张血管、抗凝血、改善血液流变学和血流动力学等作用，可用于心血管疾病的治疗[19-22]。课题组前期发现姜黄中的没药烷型倍半萜类成分具有良好的舒张血管作用[12-14]，因此本实验测定了化合物1对KCl预收缩的胸主动脉环舒张作用，但结果显示该化合物无明显活性。

5 讨论

本实验运用多种色谱分离技术从姜黄95%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中获得1 个新的裂环没药烷型倍半萜（1），并通过NOESY 和计算NΜR 确定其相对构型，计算ECD 确定其绝对构型。姜黄中含有较多的没药烷型倍半萜，但裂环没药烷型倍半萜较为少见，而且这类裂环没药烷型倍半萜在自然界中较为罕见，目前仅在姜科中分离得到[17]。化合物1 在没药烷型骨架的基础上，C-4-C-3 经氧化断键而开环，并形成丁内酯结构，而其他裂环没药烷型倍半萜的裂环位置通常在C-2 与C-3 之间[20]。尽管课题组前期发现姜黄倍半萜成分具有显著的舒张血管作用，但化合物1 对KCl 预收缩的胸主动脉环无明显活性。因此猜测裂环没药烷型倍半萜结构中的裂环对其舒张血管活性可能产生影响。本研究丰富了姜黄的化学成分，为姜黄倍半萜类成分的后续研究提供了参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突