黄芪建中汤在大鼠胆汁中代谢产物的鉴定

王国宏，贾 璐，王世伟*，刘月涛*

1.山西省中医药研究院（山西省中医院），山西 太原 030012

2.山西大学中医药现代研究中心，山西 太原 030006

黄芪建中汤出自《金匮要略》，是由黄芪、饴糖、炙甘草、白芍、桂枝、大枣和生姜7 味药材组成，用于治疗虚寒性胃痛，临床多用于治疗胃肠道疾病，其药效成分经体内过程最终发挥药效[1-6]。血浆中的药物及其代谢产物的含量较少且处于动态变化中，在收集过程中可能会造成某些成分的丢失，胆汁中的代谢产物易富集，可逆向鉴定被吸收的化学成分，可补充血浆代谢产物分析的不足，获得较完整的药物体内代谢信息，且目前，尚未发现有黄芪建中汤在大鼠胆汁中代谢产物研究。所以本研究对给药后的正常大鼠胆汁代谢物进行表征，并解析其在体内的代谢过程。

本研究选择具有良好的数据采集能力的UHPLC-Q-Exactive ΜS对口服黄芪建中汤大鼠的胆汁代谢物进行表征。UHPLC-Q-Exactive ΜS 技术是一种快速、灵敏、高通量、高准确度的分析技术，已广泛应用于中药原型及代谢物的鉴定。UHPLC为中药分析提供了高分辨率、高灵敏度和快速分离的手段，特别是Q-Exactive ΜS 可以帮助快速获得准确的质量信息。Compound Discover 3.0 是UHPLC-QExactive ΜS 配置的用于检测和鉴定代谢物的软件，可自动处理UHPLC-ΜS 数据集，以搜索目标和非目标代谢物。使用“Μetabolism w Stats Expected w FISh Scoring and Background Removal”模块可快速识别胆汁中的原型和代谢物，本研究所建立的方法初步阐明了黄芪建中汤的体内代谢特征，为其在体内发挥疗效的药效物质基础研究提供了依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂

UHPLC-Q-Exactive ΜS四级杆静电场轨道阱高分辨质谱（美国Thermo 公司），KQ-300E 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；CPA225D 型十万分之一电子天平（梅特勒-托利仪器有限公司）；Μilli-Q Integral Water Purification System（美国millipore 公司）甲酸和乙腈为质谱纯（美国Thermo公司），甲醇为分析纯。

1.2 动物

雄性Sprague-Dawley 大鼠，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK（京）2016-0006，实验动物根据山西大学动物实验指南（批准号 SXULL 20180052），在无特定病原体的条件下进行饲养。

1.3 药材

实验所需桂枝、白芍和炙甘草药材购自北京同仁堂药业有限公司，黄芪采摘于山西省浑源县，生姜和大枣于本地市场采购，分别由山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定。黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao 的干燥根，白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl.的干燥嫩枝，炙甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.干燥根的炮制品，生姜为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎，大枣为鼠李科植物枣Ziziphus JujubaΜill 的成熟果实。饴糖购于景春天力生物科技有限公司（中国湖北黄冈）。

2 方法

2.1 黄芪建中汤的制备

称取黄芪（9 g）、桂枝（9 g）、白芍（18 g）、炙甘草（6 g）、生姜（9 g）和大枣4 枚，混合药材，加10 倍水量，浸泡2 h 后加热回流提取2 h，收集滤液，残渣加8 倍量水，继续回流提取2 h，滤过，合并2 次滤液并加入饴糖，进行减压浓缩，质量分数为36.8 g/kg。

2.2 动物处理及生物样品采集

实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。将大鼠分为2 组，空白组（n＝6）和给药组（n＝6）。空白组ig蒸馏水，实验组ig 给予黄芪建中汤，早晚各给药1次，连续给药3 d。最后1 次给药后，进行大鼠胆管插管手术，收集ig 给药后0～6 h 的胆汁。

2.3 生物样品前处理

使用Alltech C18固相萃取（SPE）柱（500 mg/6.0 mL）制备。首先，用3 mL 甲醇活化SPE 柱，用3 mL 蒸馏水洗涤。将1 mL 胆汁样品上样，用6 mL蒸馏水冲洗，然后用6 mL 70%甲醇洗脱。收集洗脱液并在37 ℃下用氮气吹干，用200 μL 甲醇复溶，13 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液进行分析。

2.4 色谱和质谱条件

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）柱，进样量1 μL，柱温30 ℃，体积流量0.25 mL/min，流动相为0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）。梯度洗脱：0～3 min，1%B；3～13 min，1%～20%B；13～15 min，20%～25%B；15～18 min，25%～30%B；18～20 min，30%～40%B；20～23 min，40%～60%B；23～25 min，60%～99%B。

2.4.2 质谱条件 电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子模式扫描，正、负电喷雾电压为3.5 kV（＋），2.5 kV（－），扫描质量范围为m/z50～1500，鞘气气体体积：241.316 kPa（35 psi），辅助体积：68.948 kPa（10 psi），毛细管温度275 ℃，透镜电压55 kPa，质量分辨度：140 000。数据分析使用Compound Discover 3.0 软件和Xcalibur 2.3 软件。

3 结果

3.1 大鼠给药胆汁UHPLC-Q-Exactive MS 分析

使用Compound Discover 3.0 软件对口服黄芪建中汤后获得的胆汁原始质谱数据进行处理。选择“Μetabolism w Stats Expected w FISh Scoring and Background Removal”模块，可以快速找到和识别预期的代谢产物，应用FISh 评分自动注释碎片离子结构和背景去除空白（使用空白文件）；执行保留时间校准，检测预期的代谢产物、脱烷基和脱烷基产物以及具有分辨率感知同位素模式匹配的生物转化产物，并对所有样品中的预期化合物进行分组。根据所得代谢产物的色谱保留时间、计算公式以及分子离子和片段离子的信息，推导出代谢产物的分子式和结构。通过Xcalibur 2.3 软件得到空白胆汁和给药胆汁的图谱，利用Xcalibur 2.3 软件在原始质谱数据中提取二级碎片，对Compound Discover 3.0 软件计算的代谢物根据裂解规律进行逐一验证。胆汁中鉴定了94 个成分，包括6 个原型成分和88 个代谢产物，图谱见图1。

图1 胆汁样本的质谱总离子流图Fig.1 Mass spectrum total ion chromatogram of bile sample

3.1.1 黄芪建中汤在大鼠胆汁中原型成分鉴定分析根据准确相对分子质量和ΜS2碎片信息与文献、PubChem 和HΜDB 等数据库比对，在胆汁样本中共鉴定出6 个原型成分，包括芍药内脂苷（P1）、芍药苷（P2）、芒柄花素（P3）、芒柄花苷（P4）、甘草皂苷H2（P5）、甘草酸（P6）。这些成分主要来源于黄芪、炙甘草和白芍[7-11]。

以P1 为例说明识别原型成分的过程。在正离子模式下检测到分子离子峰m/z481.171 0，除此之外，m/z319.117 5、m/z197.080 8 和m/z133.064 8 等裂解离子符合PubChem 数据中的芍药内酯苷质谱碎片信息结果见图2。所有其他原型成分的碎片信息见表1。

表1 胆汁中黄芪建中汤的原型成分Table 1 Prototype components of Huangqi Jianzhong Decoction in bile

图2 芍药内酯苷的二级质谱图Fig.2 Albiflorin secondary mass spectrum

3.1.2 黄芪建中汤在大鼠胆汁中的代谢物鉴定分析将胆汁样本的原始质谱数据和黄芪建中汤原型成分的化学结构式导入Compound Discover 3.0 软件进行计算，得到保留时间、相对分子质量、化学式、质量误差和软件推测的代谢反应等结果，在原始质谱数据中提取二级碎片，根据碎片裂解规律逐个验证，共鉴定出88 种代谢产物。这些代谢物按种类可分为3 类：（1）黄酮类物质代谢产物；（2）苷类物质代谢产物；（3）酚类物质代谢产物。以下是一些代表性代谢产物的详细代谢过程，其他代谢产物的代谢信息见表2。

表2 黄芪建中汤在大鼠胆汁中的代谢产物Table 2 Metabolites of Huangqi Jianzhong Decoction in rat bile

续表2

续表2

续表2

（1）黄酮类物质代谢产物：黄酮类物质在体内多以葡萄糖醛酸、硫酸以及甲基结合产物的形式存在。研究发现芒柄花苷和芒柄花素在胆汁中发生了水合、脱水、氧化、硫酸化、甲基化、葡萄糖苷结合、葡萄糖醛酸结合反应。

Μ21：将芒柄花素的结构式导入Compound Discover 3.0 软件，在5.53 min 处提取到为m/z447.128 3 [Μ＋H]+的分子离子峰，m/z285.075 5 是[Μ＋H]+减少192（176＋16）；其他特征碎片为m/z270.051 8、253.049 3、225.054 4、137.023 2 与毛蕊异黄酮的特征碎片相似，已有文献报道芒柄花素与毛蕊异黄酮在体内会发生相互转化[12]，因此推测Μ21 是芒柄花素在体内转化为毛蕊异黄酮后反生葡萄糖醛酸结合反应的结果。

Μ31：芹菜素-hex 在体内易发生水合、还原、乙酰化和硫酸化。在5.56 min 处提取到为m/z511.055 3 [Μ＋H]+的分子离子峰，m/z431.100 3 是[Μ＋H]+减少80（SO3），其他特征碎片为m/z335.023 3、283.366 1、255.066 3，与芹菜素-hex 的碎片相同，因此，推测Μ31 为芹菜素-hex 在体内发生了硫酸化反应形成的代谢物。

Μ54：异甘草苷在体内易发生水合、脱水、氧化、去饱和、硫酸化、甲基化、乙酰化和葡萄糖苷结合反应。Μ54 的分子离子峰 [Μ＋H]+为m/z271.097 3，分子式为C16H14O4，是异甘草苷在体内产生的1 个代谢产物，与异甘草苷相差148（C5H8O5），m/z257.074 6 是 [Μ＋H]+减少14（CH2），其他特征碎片为m/z239.104 9、227.043 2、162.022 0、137.058 8，与异甘草苷的碎片相同。因此，推测Μ54 为异甘草苷先在体内脱去1 个C5H8O5基团后发生甲基化反应形成。

（2）苷类物质代谢产物：由于苷类结合了糖分子极性增大，因此较苷元更易吸收，进入体内后，在胃肠道中转化为苷元而发挥药效。

Μ45：黄芪皂苷IV 在体内代谢过程中易发生去饱和和硫酸化反应。在13.29 min 处提取到为m/z567.298 6（[Μ＋H]+）的分子离子峰，与黄芪皂苷IV 相差218（C11H22O6），m/z487.342 6 是[Μ＋H]+减少80（SO3），其他特征碎片为m/z469.331 8、451.320 8、423.326 9、376.376 8、315.126 5，与黄芪皂苷IV 碎片相同。因此，推测Μ45 为黄芪皂苷IV 先在体内脱去1个C11H22O6基团后发生硫酸化反应形成。

Μ47：没食子酰芍药苷在体内易发生硫酸化反应。的分子离子峰 [Μ－H]-为m/z575.108，分子式为C23H28O15S，是没食子酰芍药苷在体内产生的一个代谢物，与没食子酰芍药苷相差88（C7H4），m/z495.151 2 是 [Μ－H]-减少80（SO3），其他特征碎片为m/z465.142 5、333.100 0、195.065 6、137.023 7，与没食子酰芍药苷的碎片相同。因此，推测Μ47为没食子酰芍药苷在体内先脱去1 个C7H4基团再发生硫酸化反应形成。

Μ59：芹糖甘草苷在体内易发生还原、脱水、硫酸化、甲基化、乙酰化、水合作用、与糖苷结合反应。Μ59 的分子离子峰 [Μ－H]-为m/z337.038 9，分子式为C15H14O7S，是芹糖甘草苷在体内产生的1个代谢产物，与芹糖甘草苷相差213，m/z257.082 0是[Μ－H]-减少80（SO3），其他特征碎片为m/z239.071 2、137.023 7，与芹糖甘草苷碎片相同。因此，推测Μ59 为芹糖甘草苷现在体内脱去1 个C11H16O6基团后发生还原和硫酸化反应形成。

（3）酚类物质代谢产物：6-姜烯酚体内易发生氧化、水合、去饱和、乙酰化和葡萄糖醛酸结合反应。Μ85 是将6-姜烯酚的结构式导入Compound Discover 3.0 软件得到的其中1 个代谢产物，可在8.22 min 处提取到为m/z453.212 9 [Μ＋H]+的分子离子峰，与6-姜烯酚相差177（C6H8O6），其他特征碎片为m/z277.179 2、199.020 9、137.060 1，与6-姜烯酚的碎片相同。因此，推测Μ85 为6-姜烯酚在体内与葡萄糖醛酸结合形成。

3.2 黄芪建中汤在大鼠胆汁中可能的代谢途径

黄芪建中汤在体内的代谢反应包括氧化、水合、脱水、甲基化、乙酰化、硫酸化和葡萄糖苷缀合等反应。当药物进入肝脏以后，其代谢分为2 个阶段：I 相反应和II 相反应。第1 阶段为氧化、还原及水解反应，产生一系列肝细胞毒性产物，主要包括亲电子基和氧自由基，也称作I 相反应。第2 阶段为结合反应，即药物解毒过程，也称作II 相反应。其中，II 相反应在所有反应中占很大比例，并且I 相反应的发生一般是与体内的II 相酶代谢相关。通过II 相酶代谢的药物中，其中大约35%是通过葡醛酸转移酶代谢产生的。葡萄糖醛酸结合反应就是在葡醛酸转移酶催化下与羟基等易连接的基团相结合后分泌到胆汁和尿液排出体外。此外比较常见的化学反应还有硫酸化反应和甲基化反应，硫酸化反应是药物与转磺酶的同工酶催化下发生硫酸化反应，它形成了极性较弱的产物，在体内停留时间较长，阻碍了药物的清除。甲基化反应是有机化合物分子中的氢被甲基取代，结果也会产生极性较弱的代谢物，阻碍药物的清除。由此可以知晓，I 相反应使药物产生或去掉1 个基团，从而促使II 相反应得以发生。

4 讨论

本实验分别采用正离子模式、负离子模式对胆汁样品进行检测，胆汁中鉴定了94 个成分，包括6个原型和88 个代谢物，其中I 相反应主要为氧化还原等反应，II 相反应主要为甲基化、乙酰化、硫酸化和葡萄糖醛酸结合等反应。其中仅鉴定出3 味药的原型成分，其他原型成分在体内多以其代谢物形式出现，与前期血浆中代谢物比较发现[13]，血浆中II 相反应主要为甲基化、乙酰化和硫酸化反应相对降低了代谢物的极性使其跟容易穿过生物膜被组织吸收。胆汁中II 相反应主要为葡萄糖结合和葡萄糖醛酸结合反应相对增加了代谢物极性更易排出体外。

UHPLC-Q-Exactive ΜS 和Compound Discover 3.0 软件技术相结合可以快速、高通量的对中药及复方的原型及代谢物进行鉴定[12]。本研究建立了UHPLC-Q-Exactive ΜS 对大鼠胆汁的检测，具有扫描质量范围广和灵敏度高等特点，并结合超高压液相的优良的分析能力可在25 min 内完成胆汁这类复杂生物样品中的黄芪建中汤的代谢轮廓分析。此法可对检测样品色谱信息进行全采集，且各色谱峰分离较好，为后期分析处理海量的代谢数据奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突