高效液相色谱法测定多种形态食品中防腐类添加剂

◎ 王 兰，李宗坪，马清书,宋长远，王 研

（国家饮用水产品质量监督检验中心，吉林 白山 134300）

苯甲酸、山梨酸和糖精钠是食品中常常添加的防腐剂[1-3]，其能有效杀菌和抑制细菌生长，从而延长产品的货架存放期，提高企业的经济效益。但该类物质在食品中的添加量关系到人体健康和环境安全，已有研究表明过量的苯甲酸暴露会严重刺激眼睛，过量摄入山梨醇会引起人体的肠道问题，长期过量服用糖精钠会引发膀胱癌，还可能引发子宫癌、卵巢癌和皮肤癌等[4-5]。因此，开发对该类防腐剂进行快速、有效的检测方法，具有重要的意义[6-7]。现如今市场上的产品形态各异，液态、固态及半固态产品层出不穷，不同形态的产品有着不同的检测方法,已有一些研究可以有效检测酱油等液态产品中的防腐剂，该方法对于苯甲酸、山梨酸和糖精钠的检出限分别为0.25 mg·kg-1、0.15 mg·kg-1和0.22 mg·kg-1[8]，另外一项对于烘培食品（固态）中的防腐剂检测研究中，苯甲酸、山梨酸和糖精钠的检出限分别为6 mg·kg-1、5 mg·kg-1和1.25 mg·kg-1[9]。但各种研究之间条件各异，无法统一，不能满足多形态、高密度的检测需求，因此，提高检测方法的适用性和统一性对于食品质量的监管至关重要[10-12]，能够有效减低检测难度，提高检测效率。另外，不同的实验室环境对于方法的适用性也有一定影响，对于不同的检测目标及试验条件进行方法验证能够有效减少试验人员、仪器设备、环境等原因造成的不准确度[13]。

综上所述，本研究针对苯甲酸、山梨酸和糖精钠这3种食品添加剂，对液态、固态、半固态3种不同形态的产品（黄豆酱油、白桦树汁饮料、薄荷糖、月饼及牛肉酱），进行了高效液相色谱法的方法验证，考察了该试验条件下标准曲线的线性、方法检出限、精密度和准确度等指标，相关试验环境进行了改进与优化，大大提高了检测质量与效率，可以为相关行业提供检测参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

甲醇（HPLC级）赛默飞世尔科技公司；苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准品浓度均为1 000 mg·L-1,中国计量科学研究院；乙酸锌和乙酸铵，分析纯,国药集团；亚铁氰化钾，分析纯，沈阳市华东试剂厂；该试验用水均为去离子水。

1.2 仪器

本试验采用高效液相色谱仪（岛津LC-20AD，SB626）；50 mL离心管；25.00 mL容量瓶；10 mL、50 mL具塞比色管；0.45 µm水系滤膜。

1.3 仪器条件

采用紫外检测器，检测波长为230 nm，色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm；粒 径 为5 µm；柱 温为30 ℃），流动相为5%的甲醇和95%的乙酸铵（0.02 mol·L-1），流速设定为1.0 mL·min-1，进样量设定为10 µL。

1.4 试验样品处理

该试验的样品选取黄豆酱油、白桦树汁饮料、薄荷糖、五仁月饼和牛肉酱，准确称取均质后样品2 g于具塞比色管中，加入约25 mL纯水，混匀。在60 ℃的水浴条件下超声30 min,放置至室温，加水定容至50.0 mL，混匀后过0.45 µm水系滤膜后上机测定。如样品中含有蛋白，需加入2.0 mL的亚铁氰化钾（92 g·L-1），2.0 mL的乙酸锌（183 g·L-1），混匀后加纯水定容至50.0 mL,在4 000 r·min-1的条件下，离心5 min，取上层清夜过0.45 µm的水系滤膜后上机测定。

2 结果与分析

2.1 苯甲酸、山梨酸和糖精钠的标准曲线

为了准确确定样品中目标化学品的浓度，本试验首先进行了标准序列的测定，进而拟合回归方程、相关系数。在稀释过程中，准确吸取各标准物质5.00 mL于25.00 mL容量瓶中，纯水定容至刻度线，混匀。配成浓度为200 µg·mL-1的标准使用液（4 ℃冰箱冷藏，有效期3个月）。准确吸取标准使用液0.05 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL和5.00 mL于6个10.00 mL容量瓶中，纯水定容至刻度线，混匀。配成浓度系列1 µg·mL-1、5 µg·mL-1、10 µg·mL-1、20 µg·mL-1、50 µg·mL-1和100 µg·mL-1，运用液相色谱仪进行测定，以目标化合物浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，在1.00～200.00 mg·L-1的线性范围内拟合线性回归方程，结果如表1所示。

表1 线性回归方程及相关系数表

2.2 检出限和测定下限

根据《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）标准，取样量2 g，定容体积50 mL时，检出限均为0.005 g·kg-1,预估样液中各组分浓度为0.2 mg·L-1，取1倍预估值作为检出限，苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的按式（1）计算。经过相关计算，3种食品添加剂的检出限和测定下限结果见表2。

表2 检出限和测定下限结果表

式中：X—试样中待测组分含量，g·kg-1；

C—由标准曲线得出的样液中待测物的质量浓度，mg·L-1；V—试样的定容体积，mL；m—样品质量，g；1 000—换算系数。

2.3 精密度试验

根据1.4的方法，对1 mg·L-1、40 mg·L-1、200 mg·L-1不同浓度的标准物质进行定量测定，平行测定6次，以验证该方法的准确性。同时，对市面上可采购到的某品牌黄豆酱油进行定量测定，通过统计计算得到精密度数据，结果见表3。由表3可知，在该试验条件下，标准物质的相对标准偏差（RSD）的范围为0.040%～0.527%，试样的（RSD）范围为0.094%～0.109%，证明该方法精密可靠。

表3 精密度试验结果表

2.4 加标回收试验

本试验对某品牌白桦树汁饮料、薄荷糖和月饼3个样品进行了加标试验，称取适量样品，加入定量的标准物质后，按照1.4所述方法进行处理并测定，计算回收率，结果如表4所示。由表4可知，该方法的样品加标回收率为94.3%～103%。

表4 加标回收试验结果表

3 结论

按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》（HJ 168—2020）方法，对检测方法的检出限、测定下限、精密度与准确度进行验证，结果表明，在1.00～200.00 mg·L-1的线性范围内，测得的苯甲酸、山梨酸和糖精钠的相关系数均达到0.999 9，表明检测方法线性良好，其相对应的检出限分别为0.1 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1和0.3 mg·kg-1,低于国标方法及相关同行提供的最低检出限，相对标准偏差为0.040%～0.527%，加标回收率为94.3%～103%，说明该方法稳定精确。该方法快速、便捷、各性能指标均能达到标准检测方法的要求。对黄豆酱油、白桦树汁饮料、薄荷糖、月饼及牛肉酱等产品的检测发现该方法适用于液体、固体及半固体等形态的食品质量检测，同时该方法的验证也能大大减少人员能力、试验设备、试验环境等原因造成的试验结果不准确性，具有广泛的应用性。