同位素内标-超高效液相色谱串联质谱法测定饮料中咖啡因的含量

2021-10-12康雪梅郭倩倩李梦雨贾松涛赵雪峰赵林萍

现代食品 2021年18期

◎ 康雪梅，陶燕，郭倩倩，李新，李梦雨，贾松涛，赵雪峰，赵林萍

（河南中标检测服务有限公司，河南郑州 450001）

咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，是一种中枢神经兴奋剂，能够暂时驱走睡意并恢复精力，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。有咖啡因成分的咖啡、茶、软饮料及能量饮料十分畅销，因此，咖啡因也是世界上最普遍被使用的精神药品。过多的饮用摄入大量的咖啡因，导致作息不规律引发精神紊乱；还会引起肠痉挛。长期饮用会引发慢性胃炎，刺激肾功能，导致儿童多尿，流失大量钙质，影响骨骼发育。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，咖啡因属于3类致癌物，即“尚不能分类”的致癌物[1]。

目前，咖啡因检测方法主要有碘量法、HPLC法、近红外光谱分析法、毛细管电泳法等。近几年对于液质法的使用逐渐增多，但基本也是外标法的建立使用[2-7]。外标法对于复杂基质的测定难于避免基质效应等部分的影响。因此本文旨在建立同位素内标-超高效液相色谱串联质谱法测定饮料中咖啡因含量的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

碳酸饮料（可乐）、功能型饮料（红牛）、绿茶、咖啡等。

1.2 试剂及仪器设备

甲醇（色谱纯，美国赛默飞）；乙腈（色谱纯，美国赛默飞）；甲酸（色谱纯，美国赛默飞）；咖啡因对照品（批号G138494，纯度98.8%，美国DR）；咖啡因-D3同位素内标对照品（批号449472，100 mg·L-1，o2si）；试验用水为去离子水。

TSQ vanquish超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（美国赛默飞世尔科技）；天平，感量为0.1 mg（美国奥豪斯）；水浴锅；超声波清洗器，0.45 µm微孔水相滤膜（津腾）。

1.3 试验方法

1.3.1 对照品溶液的制备

（1）咖啡因标准储备液（1 mg·mL-1）。准确称取咖啡因标准品10 mg（精确至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，4 ℃冰箱保存。

（2）咖啡因标准中间工作液（1 µg·mL-1）。准确吸取0.1 mL咖啡因标准储备液于100 mL容量瓶中用水定容后，4 ℃冰箱保存。

（3）咖啡因-D3同位素内标标准中间工作液（1 µg·mL-1）。准确吸取1 mL咖啡因标准储备液于100 mL容量瓶中用水定容后，4 ℃冰箱保存。

（4）咖啡因标准曲线工作液。分别吸取咖啡因标准中间液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL和2.00 mL于10 mL容量瓶中，向其中分别加入0.1 mL咖啡因-D3同位素内标标准中间工作液，用水定容，得到咖啡因浓度分别为5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1，内标浓度为10 ng·mL-1，临用时配制。

1.3.2 样品的制备净化过程

（1）可乐型饮料。①脱气。样品用超声清洗器在40 ℃下超声5 min。②净化。称取5 g（精确至0.001 g）样品，加入咖啡因内标标准中间工作液（1 µg·mL-1）100 µL，加水定容至100 mL，摇匀，加入0.5 g氧化镁，振摇，静置，取上清液经微孔滤膜过滤，备用。

（2）不含乳的咖啡及茶叶液体制品。称取5 g（精确至0.001 g）样品，加水定容至100 mL，摇匀，加入0.5 g氧化镁，振摇，静置，取上清液经微孔滤膜过滤，备用。

（3）含乳的咖啡及茶叶液体制品。称取1 g（精确至0.001 g）样品，加入三氯乙酸溶液（10 g·L-1）定容至100 mL，摇匀，静置，沉降蛋白，取上清液经微孔滤膜过滤，备用。

若样品溶液中咖啡因含量超出标准曲线范围需再做稀释，相应内标加入量要增加，使内标上机浓度为10.0ng·mL-1。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱，waters ACQUITY UPLC BEH C18，粒径1.7 µm，2.1 mm×100 mm；流动相：0.1%甲醇+0.1%甲酸水；流速：0.25 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量，2 µL。

（2）质谱条件。离子源温度：350 ℃；离子化方式：ESI+源；多反应监测模式。

1.3.4 标准曲线的制作

将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以咖啡因和咖啡因-D3峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.5 试样溶液的测定

将试样溶液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以保留时间及离子峰度比双重定性，以咖啡因和咖啡因-D3峰面积比值带入标准曲线定量。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择及优化

采用不经液相，直接手动和自动注射的方式，在正、负模式下切换，选择合适的电离模式，结果显示咖啡因在正离子模式下拥有较好的响应度。然后在正离子模式下对咖啡因及咖啡因-D3进行Q1母离子及Q3子离子进行优化，选取1个母离子和2个最优子离子，并分别得到碰撞能，确定定性离子对和定量离子对，结果见表1。咖啡因及咖啡因D3的总离子流图和提取离子色谱图、棒状图见图1、图2和图3。

图1 饮料中咖啡因和咖啡因-D3经LC/MSMS分析得到的总离子流图

图2 饮料中咖啡因和咖啡因-D3经LC/MSMS分析得到的提取离子色谱图

图3 饮料中咖啡因和咖啡因-D3经LC/MSMS分析得到的提取离子棒状图

表1 咖啡因和咖啡因-D3的质谱多反应监测检测条件表

2.2 线性范围、检出限与定量限研究

用试剂分别配制浓度为0.1 ng·mL-1、 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1L、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1、200.0 ng·mL-1、500.0 ng·mL-1、1 000.0 ng·mL-1、2 000.0 ng·mL-1的咖啡因标准溶液，在上述质谱条件下测定，以浓度和峰面积绘制标准曲线。结果表明，在0.2～500.0 ng·mL-1浓度范围内，饮料中咖啡因有较高的线性拟合度，以SN＞3时标线的浓度对应样品的浓度为检出限，以SN＞10时标线的浓度对应样品的浓度为定量限。本法咖啡因的检出限为0.2 ng·mL-1（相当于1 g样品定容体积为100 mL时，检出限为20 ng·mL-1）；定量限为0.5 ng·mL-1（相当于1 g样品定容体积为100 mL时，定量限为50 ng·mL-1）。

2.3 回收率、方法重复性研究

由于市售绿茶、红牛、咖啡等饮料咖啡因含量不均，且浓度较高，添加低浓度的咖啡因研究其回收率重复性无法获取准确结果，因此本试验将咖啡因-D3标准物质添加到可乐、绿茶、红牛、咖啡中，添加浓度水平为20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、200 ng·mL-1的质控浓度溶液，平行试验10次，计算加标回收率和精密度，结果见表2。由表2可知，待测物的回收率均大于84.3%，精密度均小于12.0%。