QuEChERS净化法测定芝麻酱中黄曲霉毒素B1的含量

◎ 赛 平，崔瑞霞，宋润娜，赵喜华

（河南中测技术检测服务有限公司，河南 郑州 450000）

芝麻酱[1]是由芝麻经加工而成，若保存不当，很容易导致芝麻酱的各项指标不合格。芝麻酱是人们非常喜爱的一种食物[2]，也被列在我国食品安全监督抽检范围内，在实际抽检过程中，多次发现芝麻酱存在黄曲霉毒素B1检出甚至超标现象。黄曲霉毒素[3]具有非常强的致癌性，其毒性是砒霜的68倍。GB 2761—2017[4]制 定 了 黄 曲 霉 毒 素B1（Aflatoxin B1，AFTB1）的限量标准[4]，其中规定芝麻酱中黄曲霉毒素B1的限量为≤5.0 μg·kg-1。

黄曲霉毒素B1是黄曲霉毒素中毒性最强、危害最大的一种，长期少量食用后有可能导致肝功能受损，甚至引起肝癌。目前常用的检测方法有高效液相色谱柱后电化学衍生法[5]、高效液相色谱柱后碘试剂衍生法[6]、高效液相色谱柱后光化学衍生法[7]、酶联免疫吸附法[8]、高效液相色谱柱前衍生法[9-10]和高效液相色谱串联质谱法（LC-MS-MS）[10-11]等，其中高效液相色谱串联质谱法（LC-MS-MS）选用内标法，内标试剂一般较为昂贵，日常检测成本较高，柱前衍生法前处理过程中的待测组分损失较多，因此实验室多采用柱后衍生法，此方法适合大批量的日常监督抽检样品的检测。本研究通过QuEChERS净化法，采用高效液相色谱法-碘柱后衍生-荧光检测器法检测芝麻酱中黄曲霉毒素B1的含量，发现此方法操作简单、快速、准确，且灵敏度高，为芝麻酱中黄曲霉毒素B1的含量的测定提供了有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芝麻酱20批次，采购于河南省各超市和农贸市场。

乙腈（色谱纯），美国Fisher公司；氯化钠（分析纯），天津市富宇精细化工有限公司；磷酸氢二钠（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司；免疫亲和柱，柱容量300 ng；黄曲霉毒素B1，德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇，美国Fisher公司；异丙醇，美国Fisher公司；碘试剂（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水；0.22 μm滤膜，天津津腾；黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，安捷伦科技。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器与设备

Waters E2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；waters衍生化系统，Waters Symmetry Shield TM RP18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；数控超声波提取器（KH-500DB），昆山禾创超声仪器有限公司；电子天平（FA2004），上海舜宇恒平科学仪器有限公司；离心机（TG-16），四川蜀科仪器有限公司；氮吹仪（MAI-DCY-24Y），上海那艾精密仪器有限公司。

1.2.2 标准溶液的配制

配制黄曲霉毒素B1（C17H12O6，CAS号：1162-65-8 TMstandard）标准储备液（100 ng·mL-1）：准确移取500 μL黄曲霉毒素B1（2 μg·mL-1），溶解于甲醇溶液并用容量瓶定容至10 mL，存放于-20 ℃冰箱中。吸取适量的黄曲霉毒素B1标准储备液，用初始流动相定容至刻度，配制不同浓度的标准工作液，临用时配制。

1.2.3 样品处理

称5 g样品于含有净化剂包Quechers（含0.6 g硫酸镁，0.1 g PSA）试管中，加4 mL水、10 mL甲醇和QuEChERS提取剂（0.4 g硫酸镁、0.1 g氯化钠、0.1 g柠檬酸钠、0.05 g柠檬酸二钠），涡旋1 min后，超声荡震20 min，10 000 r·min-1高速离心5 min，上清液过滤膜，待测。

1.2.4 色谱条件

流动相A：水，流动相B：乙腈∶甲醇（50∶50）；等度洗脱：流动相A，68%，流动相B，32%；色谱柱：C18柱（柱长150 mm，柱内径4.6 mm，填料粒径5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：50 μL；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生溶液流速：0.2 mL·min-1；衍生反应管温度：70 ℃；激发波长：360 nm；发射波长：440 nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

采用Waters Symmetry Shield TM RP18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Waters XBridge C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Welchrom HPLC colum C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）4种色谱柱在相同条件下对相同浓度的标准溶液进行分析，检测分析效果和保留时间。结果显示，Waters Symmetry Shield TM RP18（4.6×150 mm，5 μm）色谱柱分离效果好，故选用该色谱柱。

2.1.2 流动相的优化

为提高目标分析物的分离效果和响应水平，实验比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈甲醇（1∶1）-水等流动相体系，结果显示采用乙腈甲醇（1∶1）-水检测黄曲霉毒素B1目标物的分离度和响应值最优，因此选用乙腈甲醇（1∶1）-水，通过改变流动相比例，达到较好的分离效果。浓度为5.0 ng·mL-1的标准物质色谱图见图1。

图1 5.0 ng·mL-1黄曲霉毒素B1标准溶液色谱图

2.2 净化方法的优化

芝麻酱中黄曲霉毒素B1的提取溶剂中，比较常见的有乙酸乙酯[5-7]、乙腈[8,11]、盐溶液[12-13]等。由于芝麻酱含有丰富的蛋白质、脂肪及多种维生素和矿物质，因此需要加入0.6 g硫酸镁和0.1 g PSA进行初次净化，提高相关药物的回收率[14-15]。本研究比较了添加0.1 g硫酸镁和0.1 g PSA、0.3 g硫酸镁和0.1 g PSA、0.6 g硫酸镁和0.1 g PSA、0.6 g硫酸镁和0.15 g PSA、0.6 g硫酸镁和0.2 g PSA 5种组合的提取效果，通过比对分析发现0.6 g硫酸镁和0.1 g PSA回收率最优，故选择其为净化方法。

2.3 检验方法的线性关系、检出限和定量限

在0.5～100.0 μg·kg-1浓度范围内，配置标液浓度为0.1 µg·mL-1、0.5 µg·mL-1、1.0 µg·mL-1、3.0 µg·mL-1、10.0 µg·mL-1、30.0 µg·mL-1和50.0 µg·mL-1的标准工作溶液，按照优化的色谱条件进行检测，用外标法定量，以目标化合物的定量峰面积为纵坐标（Y），标液浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，其线性关系相关系数R=0.999 7。采用溶剂稀释的方法，分别以3倍和10倍信噪比确定方法检出限（Limits of Detection，LOD）和定量限（Limits of Quantification，LOQ），检出限为0.1 μg·kg-1，定量限为0.3 μg·kg-1，按样品取样量为5.0 g计算，检出浓度下限为0.1 μg·kg-1，定量浓度下限为0.3 μg·kg-1，与国标方法[10]相关文献检测方法结果接近[12-15]。

2.4 检验方法的回收率和精密度

本方法采用加标回收试验来验证方法的准确度和可行性，在空白芝麻酱样品中加入标准溶液制得1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13个水平的加标样品，每个水平连续重复6次，按所述进行样品处理和结果分析，数据结果见表1。

表1 3批不同厂家的芝麻酱加标回收率及精密度实验结果表（n=6）

从结果中得出，各化合物的平均回收率为83.2%～101.0%，相对标准偏差为0.8%～8.7%，方法的准确性和精密度满足GB/T 27404—2008实验室质量控制规范食品理化检测质量控制要求[16]。

2.5 实际样品的测定

采样本监测方法对20批芝麻酱（采购于河南省各超市和农贸市场）进行检测。通过对实际样品的检测结果分析，其中11批芝麻酱检出浓度在3.54～26.9 μg·kg-1范围内，存在一定的食品安全风险。根据国家标准方法GB 5009.22—2016、SN/T 3136—2012、SN/T 3263—2012和SN/T 4921—2017等国标和进出口标准方法对检出样品进行复测，对比发现检测结果与本方法结果相对偏差小于8.7%，表明此检测方法可靠、准确，并且该检测方法存在效率高、成本低的优点。

3 结论

本研究对QuEChERS净化法测定芝麻酱中AFB1的方法进行了优化，通过实验得知其加标回收率、精密度都能达到GB 5009.22—2016的标准要求。QuEChERS净化法极具优势，有机试剂使用量节约50%以上，同时不用免疫亲和柱，经济效益至少提高50%。经验证该方法回收率和重现性良好，结果准确可靠[14]，适用于大规模测定芝麻酱中黄曲霉毒素B1[15]，是一种比较值得推广的方法。

在一定的湿度和温度条件下，黄曲霉极易引起食品霉变产生毒素，对人体健康造成威胁。因此，加强对食品中黄曲霉毒素B1快速高效的检测研究十分必要，其中样本前处理方面的研究是提高检测效率的关键点。