正交试验法优选药食同源四君子汤的提取工艺

2021-10-12张胜楠李荣乔史东林谢凤玲

现代食品 2021年18期

◎ 张胜楠，张璐，刘京，李荣乔，史东林，谢凤玲

（1.石家庄以岭药业股份有限公司，河北石家庄 050000；2.河北体育学院，河北石家庄 050000）

四君子汤出自《太平惠民和剂局方》，是一味中医方剂，具有补气，益气健脾之功效。方中人参性甘温大补脾胃之气，是为君药；白术苦温，助君药燥湿健脾，是为臣药；茯苓甘淡，健脾渗湿，是为佐药；甘草味甘性平，调和诸药，益气和中，是为使药[1]。四君子汤不仅能促进机体的造血功能，具有调节内分泌、抗氧化、提高代谢水平等作用，同时还能纠正免疫系统功能紊乱，提高体液免疫和细胞免疫的功能，具有调节胃肠功能、提高机体免疫力、抗肿瘤、抗疲劳及抗衰老等药理作用，达到健脾益气的功效[2-3]。

脾胃在中医的五行学说中属土，为“气血生化之源”，有生化万物的特性，所以称其为“后天之本”。如果脾气不升，则能源匮乏；脾精不行，则筋骨肌肉无气以生。脾胃功能的强弱，直接关系到人体生命的盛衰。然而大量的运动和锻炼耗气，易肌肉劳顿，导致肢体乏力；大量出汗，也会损伤津液，故脾先受损[4]。从现代医学的角度来看，有关肌肉与组织器官代谢相关的线粒体的结构和酶活性功能的变化，都与脾气不足发生的病理机制相关[5]。所以脾胃健康对运动有直接影响，健脾益气可缓解运动性疲劳。

根据四君子汤的功效，将原方中白术由药食同源山药代替，山药有健脾燥湿，加强益气的功效。人参、山药、茯苓、甘草四味药食同源药材组方经水提后通过干燥制得的提取物，可益气健脾，改善机体运动性疲劳。四君子汤的水煎液主要含有多糖类、皂苷类、黄酮类等其他成分，另外还包括了一些挥发油及生物碱类物质[6]。多糖类物质在生物体中普遍存在，是由糖苷键结合而成的糖链，是一类天然高分子多聚物。多糖是生物体内重要的生物大分子，它是维持生命活动正常运转的基本物质之一，也是中药主要活性成分之一[7]。

近年来，有关中药多糖类物质药理作用的研究报道逐年增加，中药多糖具有保护肝脏、抗氧化、调节免疫、抗炎、抗癌等多种药理活性，具有很大的发展潜力。鉴于其重要的免疫调节作用，中药多糖又被称为免疫活性多糖。多糖类物质来源广泛、疗效准确并且毒副作用小，因此受到人们的普遍重视[8]。多糖的提取方法有很多，如超声提取法[9]、酸碱提法[10-11]、生物酶提取法[12]、水提法[13]、微波提取法[14]等，其中水提法是最传统的提取方法，相较于其他几种方法，操作最为简单安全。对于多糖的测定，有苯酚-硫酸法[15]、蒽酮-硫酸法[16]、DNS法[17]等方法。为了更好地控制中药方剂质量，为制备工艺提供科学性依据，本文以粗多糖含量为指标，正交试验法对水提工艺进行系统考察，采用苯酚-硫酸法进行含量检测，以筛选出最佳提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

处方药材，购自河北蘭氏盛泰药业有限公司；D-无水葡萄糖标准品，购自中国食品药品检定研究院，批号110833-201908；苯酚、硫酸、无水乙醇，均为分析纯，本实验试剂如无特殊说明均为分析纯。

1.2 仪器与设备

赛多利斯（224-1CN）电子天平；电热恒温水浴锅（DK-S26）；超声波清洗器（KQ-700VDE）；紫外可见分光光度计（PE Lambda 25）；涡旋振荡器；离心机。

1.3 正交试验设计

以提取次数（A）、提取时间（B）、料液比（C）为考察因素，空列（D），以粗多糖提取率为指标，L9（34）正交试验设计表见表1。

表1 正交试验设计因素水平表

1.4 多糖提取及测定

提取物经过乙醇作用，产生沉淀，在去除其他可溶性糖和大量杂质后，粗多糖与苯酚-硫酸作用生成橙红色化合物，显色强度与溶液中粗多糖的含量成正比，最终在波长为485 nm下比色定量。

1.4.1 标准曲线的绘制

称取对照品D-无水葡萄糖100 mg放于100 mL的容量瓶中，加适量水，待葡萄糖溶解后，定容至刻度，摇匀，即得浓度为1 mg·mL-1的对照品溶液。

准确吸取葡萄糖标准使用液0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL和2.00 mL（相当于0 mg、0.02 mg、0.04 mg、0.08 mg、0.12 mg、0.16 mg和0.20 mg葡萄糖）于25 mL比色管中，加水补至2.0 mL，加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，混匀，小心加入浓硫酸10 mL，混匀，置沸水浴2 min，冷却至室温，用分光光度计在485 nm波长处以空白试剂为参比，1 cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4.2 样品提取

将药材按比例混合后提取、浓缩、干燥后得中药提取物，称取适量样品，置于25 mL容量瓶中，加水摇匀溶解，定容至刻度（V1），混匀后过滤，弃去初滤液后，收集余下的滤液供沉淀粗多糖。

1.4.3 沉淀粗多糖

准确吸取滤液5.0 mL（V2），放于50 mL离心管中，再加入20 mL无水乙醇，混匀，4 ℃的冰箱中静置4 h以上，再以4 000 r·min-1离心5 min后，弃去上清液，残渣用80%（V/V）乙醇溶液洗涤，离心后弃去上清液，重复操作3次。残渣用水溶解后定容至25 mL（V3），再吸取2.5 mL溶液至100 mL容量瓶，定容。

1.4.4 样品测定

准确吸取溶解液2.0 mL（V4）置于25 mL比色管中，测定吸光度值。从测得的标准曲线上查出葡萄糖含量，按照式（1）计算该提取物中粗多糖含量。

式中：X-提取物中粗多糖含量（mg·100g-1）；m1-提取物测定液中葡萄糖的质量（mg）；m2-提取物质量（g）；V1-提取物提取液总体积（mL）；V2-沉淀粗多糖所用样品提取液体积（mL）；V3-粗多糖溶液体积（mL）；V4-测定用样品液体积（mL）；0.9-葡萄糖换算为粗多糖的系数；40-稀释倍数。

1.5 统计分析

利用软件记录试验数据，计算药食同源四君子汤提取物粗多糖含量，正交试验设计和结果采用正交设计助理IIV 3.1进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 提取工艺优化

由表2知，由均值得该中药组合物的最佳提取工艺为A3B3C1；由正交试验表得粗多糖含量最高的为第9组（A3B3C2）。由表3知，提取次数（A）与提取时间（B）对结果有显著影响（P＜0.05），而料液比无显著性影响。

表2 正交优化试验结果分析表

表3 正交优化实验方差分析表

2.2 最佳提取工艺与优选提取工艺的对比

为了确定此中药组方水提工艺的优劣和稳定性，在正交试验的基础上，结合实际生产中节能减排（节电、节水、节时间）的相关政策，在粗多糖得率较高的实验6、实验8和实验9中，确定实验8为优选工艺1（A3B2C1），实验6为优选工艺2（A2B3C1）。即优选工艺1为提取次数3次、提取时间90 min、料水比1∶8；优选工艺2为提取次数2次、提取时间120 min、料水比1∶8，进行中药提取物粗多糖测定分析，考虑到试验中可出现的误差，重复3次，对比结果如表4所示。