蛋白激酶C-α信号通路在尼古丁诱导的脐静脉内皮细胞PAI-1表达中的作用

吕 茹，裴 硕，樊芳芳，张 潍，冉博文，胡晓芸

研究表明，吸烟可造成血管内皮损伤，促进血小板的聚集与黏附，是动静脉血栓形成的独立危险因素[1]。组织纤溶酶原激活剂(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)是纤溶系统的一对重要的调节因子，主要由血管内皮细胞产生和分泌。尼古丁为香烟烟雾的主要有害物质之一，本课题组前期实验证实，尼古丁通过打破内皮细胞t-PA/PAI-1的动态平衡，增加血栓形成的风险[2]。蛋白激酶-α(PKC-α)是细胞内重要的生物信息转导通路，属PKC亚型中的钙离子依赖型或经典型。PKC激活是血管内皮功能紊乱的关键环节之一[3]，但不同刺激物诱导内皮细胞PAI-1活化其信号转导通路不尽相同，PKC-α信号通路是否在尼古丁诱导的内皮细胞纤溶功能紊乱中发挥作用有待证实。本研究通过尼古丁及PKC抑制剂Staurosporine(STS)处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，观察各组细胞PAI-1的表达变化及伴随的PKC-α通道蛋白的变化，探讨吸烟引起内皮细胞纤溶紊乱的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂 HUVECs细胞株购自上海门堞塔生物科技发展有限公司，为ATCC来源细胞株。尼古丁、STS均购自美国Sigma公司。RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司。胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司。PAI-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海太阳生物技术公司。聚合酶链式反应法(PCR)引物、内参照GAPDH引物由上海生工生物工程公司合成。Trizol RNA提取试剂盒、实时荧光聚合酶链式反应法(RT-PCR)试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。β-actin抗体、小鼠PKC-α单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠二抗均购自美国Santa Cruz公司。荧光FITC标记的羊抗小鼠IgG单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 HUVECs的培养与分组 用10%FBS的RPMI-1640培养液，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养细胞，隔日换液1次，待细胞生长至亚融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化液以1∶2传代，将传代后的细胞用于实验。将生长良好的HUVECs传代后接种于25 cm×25 cm培养瓶中，接种密度5×105个/mL，每瓶5 mL，根据随机数字表法分为4组：①对照组，培养液中不加任何干预；②尼古丁组，培养液中加入100 μmol/L尼古丁；③STS 组，培养液中加入100 nmol/L STS；④尼古丁+STS组，培养液中先加入100 nmol/L STS预处理细胞30 min，再加入100 μmol/L尼古丁。细胞孵育12 h后收集各组的细胞及上清液。每组均设4个复瓶，重复3次。

1.3 PAI-1蛋白测定 采用ELISA法检测各组HUVECs上清液中PAI-1蛋白含量，操作步骤严格按照试剂盒说明进行。PAI-1标准品浓度分别为120 μg/L、60 μg/L、30 μg/L、15 μg/L、7.5 μg/L、3.75 μg/L及1.875 μg/L。

1.4 PAI-1 mRNA测定 采用RT-PCR法检测各组HUVECs中PAI-1 mRNA表达水平。按Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA，取5 μL cDNA进行PCR的扩增反应。PAI-1引物序列：正向引物5′-TGCCCTCTACTTCAACGG-3′，反向引物5′-GTCGGTCATTCCCAGGTT-3′，扩增产物片段390 bp。GAPDH引物序列：正向引物5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，反向引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，扩增产物为307 bp。PCR反应条件：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共32个循环。采用相对Ct值法检测PAI-1 mRNA，结果以Ct值表示，相对于β-actin或GAPDH的比值为2-ΔΔCt。其中，Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.5 HUVECs的PKC-α定位变化 采用免疫荧光染色法检测各组HUVECs的PKC-α定位变化。具体操作步骤(均避光进行)：将盖玻片置于6孔培养板中，生长良好的HUVECs重悬于完全培养基中，接种密度2×104个/mL，待细胞长满盖玻片后去除上清液，按STS干预实验随机分组并干预，孵育12 h后收集盖玻片，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗2次，以4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，制成细胞爬片。取固定好的细胞爬片，PBS洗涤2次，重悬于PBS(1∶100)及PKC-α一抗(1∶300)中，在37 ℃孵育1 h。PBS洗涤3次后，将细胞重悬于含荧光FITC-羊抗小鼠IgG二抗(1∶30)的缓冲剂中，37 ℃孵育1 h。PBS洗涤3次后，进行4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，PBS洗涤2次，荧光显微镜下观察各组HUVECs的PKC-α定位变化。

1.6 胞膜与胞浆PKC-α表达水平测定 采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测各组HUVECs胞膜与胞浆PKC-α表达水平。取分组处理的冻存细胞，按10 μL/mg的比例加入预冷的胞浆蛋白裂解液，充分溶解细胞。4 ℃、3 000 r/min离心30 min，取其上清液为胞浆蛋白成分。沉淀物再加相同体积的膜相关蛋白裂解液，同上述离心条件处理后，取其上清液为膜相关蛋白成分。电泳分离胞浆及胞膜蛋白后转膜，PKC-α一抗(1∶1 000)及β-actin一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，清洗一抗后HRP标记的羊抗鼠二抗(1∶1 000)室温孵育2 h，增加化学发光法显色后，将所得结果经高分辨多功能分析图文分析系统采集，进行灰度分析，各组PKC-α条带与β-actin条带灰度值的比值表示PKC-α的蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 各组HUVECs PAI-1蛋白及mRNA表达水平比较 尼古丁组PAI-1蛋白及mRNA表达水平均较对照组升高，差异均有统计学意义(P均<0.01)；尼古丁+STS组PAI-1蛋白及mRNA表达水平较尼古丁组下降，但仍高于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.01)。详见表1。

表1 各组HUVECs中PAI-1蛋白、mRNA表达水平比较 (±s)

2.2 尼古丁对HUVECs中PKC-α定位的影响 对照组HUVECs中PKC-α的绿色荧光均匀分布于细胞浆中；尼古丁孵育后胞内PKC-α发生移位，在细胞膜出现明显的绿色荧光；STS处理组胞浆的绿色荧光减弱；尼古丁+STS组细胞膜荧光强度低于尼古丁组。详见图1。

图1 尼古丁对HUVECs中PKC-α定位的影响

2.3 各组HUVECs胞膜与胞浆PKC-α蛋白表达水平比较 蛋白免疫印迹法显示各组均有一条80 kDa 的蛋白带。尼古丁组胞膜PKC-α蛋白增高，胞浆PKC-α蛋白降低，胞膜/胞浆PKC-α蛋白表达增高，与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。尼古丁+STS 组胞膜PKC-α蛋白较尼古丁组降低，胞浆PKC-α蛋白较尼古丁组升高，胞膜/胞浆PKC-α蛋白较尼古丁组降低，差异均有统计学意义(P均<0.01)。详见图2、图3及表2。

图2 各组HUVECs胞膜PKC-α蛋白的表达

表2 各组HUVECs胞膜与胞浆PKC-α蛋白表达比较 (±s)

2.4 胞膜PKC-α蛋白与PAI-1 mRNA、蛋白表达的关系 胞膜PKC-α蛋白表达与PAI-1 mRNA及蛋白表达呈正相关(r值分别为0.813、0.882，P均<0.05)；胞浆PKC-α蛋白与PAI-1 mRNA及蛋白表达呈负相关(r值分别为-0.744、-0.797，P均<0.05)。详见图4。

图4 胞膜、胞浆PKC-α蛋白与PAI-1 mRNA、蛋白表达的关系

3 讨 论

吸烟与多种血栓性疾病的发生密切相关，尸检和临床研究表明，吸烟对受损的内皮细胞有直接毒性作用，可导致凝血功能改变和血小板反应性增加，这与动脉粥样硬化形成的致病性有关[4-5]，吸烟也是静脉血栓形成的独立危险因素[6]。目前，吸烟引起静脉血栓形成的具体机制尚不清楚，因此，探讨香烟烟雾的主要有害物质尼古丁对静脉内皮细胞纤溶平衡的影响及其机制具有重要意义。

血管内皮细胞在维持血小板聚集以及维持凝血和纤维蛋白溶解的平衡方面起着核心作用，PAI-1释放失调会破坏凝血和纤溶平衡，导致血栓形成[7]。本课题组前期在吸烟与内皮细胞PAI-1表达方面已有一系列研究，杜艳等[2]的体外实验表明，尼古丁可上调血管内皮细胞PAI-1蛋白和mRNA的表达，从而抑制内皮细胞的纤溶活性。PKC是一类磷脂依赖性蛋白激酶，其包括3大类12个亚型，PKC-α属PKC亚型中的钙离子依赖型或经典型，通常存在于多种细胞的胞浆中，在内皮细胞增殖凋亡调控、炎性因子黏附及内皮通透性改变等方面发挥作用[8]。有研究表明，当细胞受到内外因素的刺激后，可导致其胞内PKC-α表达增加并伴随其转位。因此，PKC的转位被认为是其活化的标志[9]。在尼古丁介导HUVECs表达PAI-1时PKC-α的表达变化及其活性转位特征研究尚少。

朱朝霞等[10]研究发现PKC-α主要分布于血管内膜和外膜，且随着暴露时间的延长，PKC-α表达逐渐增加，提示PKC-α在烟雾暴露肺血管重构中起重要作用。本实验在前期研究基础上，进一步观察了在尼古丁上调HUVECs表达PAI-1的过程中PKC-α信号转导通路在其中的作用，结果显示尼古丁组PKC-α胞膜蛋白表达较对照组明显增高，STS阻断后尼古丁组胞膜蛋白降低，提示尼古丁可致HUVECs胞膜PKC-α蛋白的表达发生变化。相关性分析结果显示，PKC-α胞膜蛋白与PAI-1呈正相关，PKC-α胞浆蛋白与PAI-1呈负相关，提示PKC-α活化参与了尼古丁诱导的内皮细胞纤溶功能紊乱，与国内一些研究结果[3，11-12]相似。文献报道，PKC活化方式依类型细胞、刺激物及其亚型而不同，有的由胞浆转移至胞膜、细胞骨架处，有的则转移至核周或核内[9，13-16]。免疫荧光染色可见，尼古丁干预后HUVECs PKC-α胞浆荧光减弱，而在胞膜出现明显的绿色荧光，尼古丁联合STS干预后上述改变被部分抑制，表明尼古丁处理后HUVECs胞浆中的PKC-α活化，其方式是由胞浆转位至胞膜，提示尼古丁促进内皮细胞PAI-1表达增强部分是通过PKC-α信号通路的激活而实现的，进而推断减少烟雾吸入或使用PKC-α抑制剂可能有益于保护内皮细胞的纤溶功能，防止血栓性疾病的发生。

总之，在尼古丁上调HUVECs表达PAI过程中，伴随内皮细胞胞膜、胞浆PKC-α蛋白的表达变化及PKC-α的膜转位，并且胞膜PKC-α蛋白与PAI-1表达呈正相关，PKC-α活化移位可能是尼古丁介导内皮细胞纤溶紊乱的关键步骤之一。