鸡枞菌菌圃微生物的分离纯化及初步鉴定
2021-10-12张明星张玄妮李欢欢徐学锋
张明星 李 洁 张玄妮 李欢欢 谢 娟 徐学锋
(华南农业大学食品学院,广州 510642)
鸡枞菌(Termitomyces spp.)主要分布于非洲南部、南亚、东亚以及南太平洋岛屿等热带、亚热带地区,且有研究表明,亚洲与非洲的鸡枞菌存在明显的洲际地理差异[1-2]。目前,我国江苏、福建、台湾、广东、广西、四川、贵州、云南等省均有鸡枞菌分布[3]。鉴于鸡枞菌与白蚁具有紧密的共生关系[鸡枞菌与白蚁共栖于同一生境“菌圃”(即蚁巢,是由白蚁、白蚁排泄物、鸡枞菌及相关的环境微生物协调发育而成的一个共生生态系统)中],故其分布范围与大白蚁亚科(Macrotermitinae)的分布极为相近[4-5]。
鸡枞菌菌圃中存在大量的微生物,常见真菌类群有炭角菌属(Xylaria)、拟青霉属 (Paecilomyces)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)等17属[6-7]。有研究发现,虽然菌圃中存在大量对鸡枞菌生长有威胁的微生物,尤其是炭角菌属真菌和木霉属真菌,且这些真菌也能在菌圃被遗弃时迅速占领菌圃成为优势菌群[8-9],从而影响鸡枞菌的生长。但通过分子手段在活的菌圃中仅能检测到鸡枞菌[10],且相关研究也表明,菌圃中存在能抑制这些真菌生长的微生物。例如,菌圃中的芽孢杆菌属(Bacillus)能保护菌圃免受哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)的入侵[11-12],放线菌(Actinobacteria)能抑制假单胞菌(Pseudomonnas)的生长[13]。当然,菌圃中并非所有的真菌都不利于鸡枞菌的生长,例如,真菌Gigantropanus sp.能在体外刺激鸡枞菌菌丝体的生长[14]。基于这种复杂的共生关系,鸡枞菌生长的秘密始终未被揭示,使得人工驯化困难重重。在此背景下,笔者拟通过分离纯化鸡枞菌菌圃中的微生物,研究菌圃内部微生物的主体类群,并进一步分析菌圃内部微生物的相关联系,从而为阐明鸡枞菌-白蚁-菌圃三元共生体系的内在联系提供初步的研究方向。现将相关研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 试验材料
野生鸡枞菌子实体和菌圃发现于华南农业大学,并由食品学院应用真菌实验室保存。
试验试剂为牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麦芽浸提物、可溶性淀粉、高氏一号培养基(广东环凯微生物科技有限公司),葡萄糖、氢氧化钠、盐酸、氯化钾(天津福晨化学试剂厂),氯化钙、氯化钠、重铬酸钾(天津富宇精细化工有限公司),链霉素、氨苄青霉素(美国Biosharp公司),胆酸钠(天津市科密欧化学试剂有限公司),磷酸盐标准缓冲液(pH=6.85)、硼酸盐标准缓冲溶液(pH=9.14)(天津市天新精细化工有限公司)。
试验仪器为HVE-50型全自动高压灭菌锅(日本Hirayama公司)、Mettler-Toledo GB204型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)、电子显微镜XSP-8CE(上海蔡康光学仪器公司)、SW-CJ-1F超净工作台(江苏苏州安泰空气技术有限公司)、TG-16W台式高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)、FSH-2A可调高速均质机(常州市国旺仪器制造有限公司)、LRH-250A型生化培养箱(广东省医疗器械厂)、SPH-2102C立式恒温培养振荡器(上海四平试验设备有限公司)。
1.2 菌种分离配方
1.2.1 土壤浸提液
土壤取自菌圃周围。土壤与水按质量比1∶1搅拌混合均匀,取上清液。
1.2.2 牛肉蛋白胨培养基
配方为牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、琼脂20.0 g,用土壤浸提液定容至1 L,pH为7.4~7.6,在121 ℃高压条件下灭菌20 min。
1.2.3 改良马丁培养基
配方为葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁1.0 g、琼脂20.0 g,用土壤浸提液定容至1 L。
1.2.4 改良高氏培养基
取高氏一号培养基22.5 g,用土壤浸提液定容至1 L。
1.2.5 分散剂
1%胆酸钠、7%生理盐水用于细菌和真菌分离;1%焦磷酸钠、7%生理盐水用于放线菌分离。
1.2.6 抑菌剂
用链霉素10 mg/L、青霉素80 mg/L、重铬酸钾55 mg/L进行真菌分离,用重铬酸钾10 mg/L进行放线菌分离,细菌分离则不加抑菌剂。链霉素、青霉素采用0.22 μm的微孔过滤膜过滤除菌,重铬酸钾采用高温高压灭菌。
1.3 试验方法
微生物分离方式参考闫伟[15]提及的方式,并对其分离条件进行适当优化。分离在无菌条件下操作,取1 g不同位置的菌圃,放入装有99 mL分散剂的250 mL锥形瓶中,在转速10 000 r/min条件下工作1 min左右,再加10粒无菌玻璃珠,于28 ℃恒温摇床上振荡6 h,然后进行10倍梯度稀释,稀释倍数为10-2至10-6。
待溶解培养基温度降至45~55 ℃时,加入相应的抑菌剂并混匀,倒平板。取0.1 mL的菌圃稀释液涂布分离,细菌分别在10-4、10-5、10-6梯度上取,放线菌分别在10-3、10-4、10-5梯度上取,真菌分别在10-2、10-3、10-4梯度上取,每个梯度均设3次重复。
细菌和放线菌培养2~7 d,每天观察记录菌落形态,然后依据菌落形态进行分离纯化,再进行革兰氏染色,然后进行镜检。
将纯化的真菌菌株接种于PDA平板上,置于25℃培养箱内培养,每隔24 h观察菌落颜色、质地、形态以及培养基颜色、渗出物、气味等,同时结合显微形态对真菌进行初步鉴定,并统一编号。真菌形态学特征鉴定主要参照《真菌鉴定手册》《土壤真菌手册》《中国真菌志》等资料。
2 结果与分析
2.1 细菌和放线菌分离纯化
根据鸡枞菌菌圃中可培养菌株在平板上和在显微镜下的形态特征,对菌种进行初步分离,结果见表1。由表1可知,从菌圃中分离出的细菌和放线菌菌株共有383株,菌落形状以椭圆形为主,大多呈扁平、隆起,表面质地以湿润居多;菌株多为杆状,其次为球状;菌株以革兰氏阳性为主,革兰氏阴性菌株仅44株。
表1 菌圃中可培养细菌和放线菌分离株形态特征
2.2 真菌分离及初步鉴定
由表2可知,经初步分离,得到了47株丝状真菌,通过查阅相关文献,以其形态学特征为依据,初步鉴定出43株菌株,有4株无法鉴定。在这43株菌株中,有17株为木霉属,6株为曲霉属,3株为炭角菌属,5株为青霉属,3株为交链孢霉属,3株为镰孢霉属,1株为链霉菌属,1株为高山被孢霉属,1株为毛霉属,1株为截盘多毛孢属,1株为枝孢霉属,1株为鸡枞菌属。43株丝状真菌菌株的具体特征见表3。
表2 菌圃中真菌分离株在各属的分布
表3 菌圃中真菌分离株的具体特征
3 结论与讨论
鉴于菌圃微生物的分离受分散剂、分散方式、培养基及培养条件等因素的影响,本研究在参考闫伟[15]的分离方法后,根据本研究材料特点,对分散剂、分散方式、培养基等进行了适当优化,最终取得了较好的分离效果,从鸡枞菌菌圃中成功分离出了383株细菌及放射菌、47株丝状真菌,其中能根据菌株形态学特征进行初步鉴定的丝状真菌有43株。但这43株丝状真菌的属与前人研究结果(鸡枞菌圃中主要存在的丝状真菌有炭角菌、木霉、青霉、拟青霉、曲霉、芽枝霉等[8-9,16-17])有所差异。另外,本试验除了分离出炭角菌、木霉、青霉、曲霉等真菌外,还分离出了交链孢霉、镰孢霉、链霉菌、高山被孢霉、毛霉等真菌,这可能与白蚁所处的地域、白蚁的饮食和习性有关。
鉴于鸡枞菌菌圃成熟程度不同,其菌群结构存在差异,在以后的研究中,可利用人工饲养系统[18],对婚飞前(刚婚飞)的白蚁巢穴中的菌圃和出菇后的菌圃进行挖掘,并以白蚁新鲜粪便为对照,全面观察鸡枞菌生长周期中的菌群变化情况,找出其中主要发生变化的菌群,并对其基质成分进行分析,以期了解菌群变化与基质成分之间的关系。同时,未来也可通过共同培养,探明对鸡枞菌生长有促进作用的真菌菌株。