前列腺增生组织中4个上调基因的表达及意义

刘建民，张新华

(武汉大学中南医院泌尿外科，湖北武汉 430071)

良性前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia，BPH)是一种缓慢进展的中老年男性常见疾病[1]。虽然药物及外科手术治疗能够延缓BPH的临床进展，但尚无分子标志物能够准确预测BPH的临床进展。此前，我们通过二代基因测序，发现了一些BPH中表达上调的基因[2]。其中包括白介素21受体(interleukin-21 receptor，IL-21R)、多效生长因子(pleiotrophin，PTN)、基质重塑相关5(matrix remodeling associated 5，MXRA5)和胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)。同时，我们发现：IL-21R通过促进上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，从而促进BPH的发展[3]；MXRA5通过激活丝裂原活化蛋白激酶通路，促进前列腺的增殖[2]；IGF-1也参与维持BPH增殖与凋亡的平衡[4]。报道发现，雄激素能够调节前列腺组织内PTN的转录和分泌[5]。这提示PTN可能作为雄激素的下游靶分子间接参与BPH的发生发展。

1 材料与方法

1.1 标本及临床资料收集收集来自武汉大学肝胆移植中心脑死亡并接受器官捐赠的5例年轻患者的正常前列腺组织，年龄为(28.2±4.4)岁。收集2018年9月至2019年9月在我院泌尿外科接受经尿道前列腺电切除术(transurethral resection of the prostate，TURP)的BPH前列腺组织标本104例。所有TURP切除组织的标本切片由我院病理科医师经病理学诊断为BPH。同时收集对应患者的基本信息及相关临床检查信息，包括年龄、体质指数、前列腺体积、总前列腺特异性抗原(total prostate specific antigen，tPSA)、游离PSA(free PSA，fPSA)、最大尿流率、残余尿、国际前列腺症状评分(International Prostate symptom Score，IPSS)及夜尿次数。所有人体标本的收集和处理均按照我院伦理委员会批准的指南进行。

1.2 组织芯片制备将所有组织标本固定于10%中性甲醛缓冲液中，并以石蜡包埋后切片进行苏木精-依红(HE)染色。经高年资病理科医师对HE染色切片的代表区域进行评估，并标记组织芯片靶点。使用组织芯片制作仪(mitogen公司)制作组织芯片，取样直径1.5 mm，以16×10点组织列阵，共104个点。制备完成的组织芯片以4 μm厚度连续切片。

1.3 免疫组织化学染色先将组织石蜡切片脱蜡，然后在柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)中进行抗原恢复。在0.3%(体积分数)H2O2中封闭后，以1∶100稀释比孵育一抗IL-21R(abcam公司)、PTN(abcam公司)、MXRA5(abcam公司)及IGF-1(abclonal公司)，然后以二抗孵育。用过氧化物酶和3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐显色，并在Olympus-dp72光学显微镜(Olympus公司)下观察，选取镜下5个视野并拍照，使用Image J分析并计算阳性表达面积比。

2 结 果

2.1 一般资料104例BPH患者的基本情况见表1。

表1 104例BPH组织芯片临床信息及相关蛋白表达量

2.2 组织学表达定位图1显示：IL-21R和PTN均在增生前列腺组织上皮部分表达丰富，而在前列腺间质部分几乎没有表达；MXRA5主要表达在增生前列腺间质部分，而在前列腺上皮部分仅有微弱的表达；强染色的IGF-1棕色颗粒满布于整个视野中，提示IGF-1无论在上皮成分还是间质成分，都有非常丰富的表达。同时，免疫组织化学染色结果表明，与正常前列腺组织相比，IL-21R、PTN、MXRA5及IGF-1在增生前列腺组织中的表达显著增加。

IL-21R：白介素-21受体；PTN：多效生长因子；MXRA5：基因重塑相关5；IGF-1：胰岛素样生长因子。

2.3 四个蛋白的表达量与BPH临床进展因素的Pearson相关分析见表2。IL-21R蛋白的表达水平与BPH患者的前列腺体积、最大尿流率及夜尿次数呈正相关(P<0.05)，而与年龄、PSA及IPSS评分均无显著相关性；PTN蛋白水平仅与BPH患者的游离PSA水平正相关(P<0.05)；MXRA5蛋白水平与BPH患者的前列腺体积(P<0.05)及IPSS评分(P<0.01)正相关；IGF-1蛋白水平与BPH患者的前列腺体积(P<0.01)及残余尿量正相关(P<0.05)。

表2 不同蛋白表达量与前列腺增生临床进展危险因素的相关性(r值)

3 讨 论

本研究通过收集BPH组织标本制作组织芯片，应用免疫组织化学染色法计算上述4个差异基因的表达水平，分析其与BPH临床进展危险因素的相关性。结果发现，IL-21R、PTN、MXRA5及IGF-1在BPH组织中的表达显著增加。此外，IL-21R主要表达于前列腺上皮，与BPH患者的前列腺体积、最大尿流率及夜尿次数呈正相关；PTN主要表达于前列腺上皮，仅与BPH患者的游离PSA水平正相关；MXRA5主要定位于前列腺间质中，与BPH患者的前列腺体积及IPSS评分正相关；IGF-1分布于前列腺上皮及间质中，与BPH患者的前列腺体积及残余尿量正相关。

在临床上，BPH患者多伴有前列腺炎。有研究表明，伴有前列腺炎发生的BPH患者具有更大的前列腺体积、更快的临床进展以及更高的手术治疗率[3]。此前，我们使用前列腺细胞与单核细胞THP-1共培养系统及BPH伴前列腺炎的大鼠模型，阐明了IL-21R在前列腺增生组织中高表达，并可以通过调控前列腺增殖与凋亡的平衡及EMT来促进BPH的发生发展[3]。本研究从人前列腺组织标本出发，是对前期实验的补充及延伸，进一步证实了IL-21R与BPH临床进展的危险因素相关。

雄激素是BPH发生发展的必要条件，而不是充分条件。证据表明，细胞生长因子与类固醇激素之间的相互作用可能导致细胞增殖与细胞凋亡的失衡从而诱导BPH的发生。因此，生长因子可能是雄激素最初的作用靶点。在BPH中表达上调的PTN及IGF-1都属于生长因子。有研究发现，过表达IGF-1的转基因鼠出现明显的前列腺增大[6]，我们的前期实验证实IGF-1的确可以影响体外培养的前列腺细胞的增殖水平。一项对中国人的研究发现，体内循环的IGF-1和IGFBP-3的水平与BPH明显相关[7]，而2003年在对美国明尼苏达州奥姆斯特县(Olmsted County)的一项群体研究中并没有发现IGF-1与前列腺体积的相关性。这种结果差异，可能是因为被检测人群的不同以及检测方法的不同。

我们最近发现，MXRA5在BPH中发挥重要的作用[2]。由于MXRA5在前列腺间质中有着丰富的表达，我们在体外培养的前列腺间质细胞WPMY-1中转染小干扰RNA，发现下调MXRA5基因后可以延缓细胞的生长并引起细胞周期阻滞，该过程与MAPK通路的激活有关。本研究发现MXRA5蛋白的表达水平与前列腺体积及IPSS评分显著相关，提示MXRA5有可能成为预测BPH临床进展的分子标志物。

综上所述，基于此前我们对IL-21R等4个指标在BPH发生发展中的作用及机制研究，我们发现IL-21R、PTN、MXRA5及IGF-1在一定程度上与BPH的临床进展危险因素显著相关，提示这4个基因有望单独或结合起来成为预测BPH临床进展的分子标志物。