野生东方草莓茎尖培养体系的建立

韩春妮， 王军利， 豆秀英， 张阿宁， 李美索， 仝玉琴， 冯馨乐

(1.咸阳职业技术学院，陕西 咸阳 712046； 2.永寿县农技推广中心， 陕西 永寿 713400； 3.淳化县农技推广中心， 陕西 淳化 711200； 4.礼泉县植保植检站， 陕西 礼泉 713200)

0 引言

【研究意义】草莓为蔷薇科草莓属草本水果。全球有草莓属植物50余种，在全球广为栽培的草莓栽培种是通过八倍体凤梨草莓(Fragariaananassa)培育而成，而其他倍性的草莓属植物，多以野生或半野生状态分布于世界各地[1-3]。全球常见的野生草莓约有20种，中国自然分布11种左右[1-5]。可见，中国的草莓种质资源十分丰富，基因库较大。由于历史原因，中国草莓育种工作一直比较落后，中国广为栽培的草莓种基本引种自欧美或日本，自有知识产权的栽培种较少[3-6]。因此，培育自有知识产权的草莓栽培种对促进我国草莓种植业的发展具有重要现实意义。【前人研究进展】近年来，为培育中国自有知识产权的草莓栽培种，增强草莓栽培种的选择性，同时，为把中国野生草莓特有的抗逆性强、香味浓郁、果色丰富等优质基因引入栽培种，我国科学家进行不懈努力并取得一定成效[7-10]。【研究切入点】广泛分布于陕西省秦巴山区的东方草莓，为四倍体野生草莓[1]，其野生环境为海拔600～1 800 m的林间或沟坎荒坡、砂地、草丛，该野生种植株较矮，匍匐茎细长，具有较强的抗逆性，耐寒、耐旱能力非常强；其叶片呈卵形且较小，两性花；果实为圆形或椭圆形，深红色；种子陷于果面下；果肉细腻，果香浓郁[3-7]。目前，此珍贵的野生草莓种质资源还未得到充分有效的利用。【拟解决的关键问题】以野生东方草莓匍匐茎的茎尖为材料，研究东方草莓的茎尖组培快繁技术，为其离体染色体加倍等育种工作提供前期材料，促进野生草莓种质资源的有效利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的东方草莓野生资源采集自陕西省太白山自然保护区。2018年5月中旬，东方草莓果实成熟期，于陕西省太白县的太白山自然保护区挖回多株，栽培于咸阳职业技术学院园林园艺实训基地，设立专门圃地，根据其匍匐茎、花、果实、叶片等器官的形态特征，运用雷家军等[8]相关的鉴定资料和方法，以及《中国植物志》《中国果树分类学》《秦岭植物志》等资料[9-11]，对其进行检索与鉴定，确定其为东方草莓。

1.2 试验方法

1.2.1 活性炭对东方草莓褐化的影响及无菌苗的获得 2019年5月下旬，于晴天午后选取健壮、无病虫害的东方草莓苗，用手术剪剪取长度为1.0～2.0 cm的匍匐茎顶端多枚放于大烧杯中，流水冲洗12 h以上，在超净工作台上用无菌镊子将其夹出，放入盛有75%酒精的烧杯中消毒20～25 s，再用2%的NaClO消毒15 ～20 min，无菌水冲洗3～5次，再用高温、高压灭菌后的滤纸吸干表面水分，放置在垫有灭菌滤纸的培养皿中，用高温灭菌后晾凉的解剖刀切取长0.5～0.8 cm的茎尖(带1个叶原基)作为外植体，接种在基本培养基为MS，并添加0.4 mg/L 6-BA、6 g/L琼脂粉及30 g/L蔗糖的固体培养基上，pH 5.8～6.0。

为研究活性炭对外植体褐化的影响，活性炭的添加量设置4个对比梯度，分别为0 g/L、0.5 g/L、 1.0 g/L、1.5 g/L。每个培养瓶接种5个外植体，每组试验接种20瓶。接种后将培养瓶放置在培养室中培养，观察外植体污染情况，1 d后及时将未发生污染的外植体转接到相应的同类新培养基上。培养条件：光照时长为12～14 h/d，光强为1 800～2 200 lx，温度为(22±2)℃。在外植体接种的消毒过程中，由于东方草莓通体被有较长绒毛，为使消毒彻底，消毒过程不断摇动烧杯或用无菌玻璃棒不断搅拌。接种4 d后，无菌苗开始褐化。21 d时，统计褐化情况，并计算褐化率。

1.2.2 不同浓度6-BA对东方草莓离体增殖的影响 基本培养基为MS培养基，添加蔗糖30 g/L，琼脂粉6 g/L，pH5.8～6.0，NAA浓度为0.1 mg/L。6-BA设置6个浓度处理：0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.6 mg/L。选取由茎尖培养而得的生长均匀、高度4～5 cm、具有4～5片叶子的东方草莓无根试管苗，将其接种到相应培养基上。每个培养瓶接种5个无根试管苗，每个处理接种10瓶。接种30 d后，统计外植体增殖倍数。

1.2.3 基本培养基和生长素种类对东方草莓生根的影响 基本培养基设置MS培养基和1/2 MS培养基2个试验，生长素类调节剂选择IBA和NAA 2种，每种调节剂设置0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L共 4种浓度。无根草莓试管苗的选取：在MS+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA培养基上增殖培养而得的生长健壮的无根草莓苗，高度5 cm左右，具有4～5片叶子。每种培养基接种10瓶，每瓶接种3株无根试管苗。接种21 d后，观察根系生长情况，并统计生根数。

1.3 数据处理

试验数据运用SPSS19.0进行统计分析及结果差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 培养基活性炭不同添加量东方草莓外植体的污染及褐化情况

由表1看出，培养基活性炭不同添加量各处理东方草莓外植体的污染率无显著差异，说明污染率和培养基无关系。培养基中添加活性炭，对褐化的影响比较显著。不添加活性炭的培养基，其外植体褐化率高达84.1%，褐化致死率达51.2%；培养基添加活性炭后，褐化率及褐化致死率均大幅下降。东方草莓的外植体接种时，培养基中添加活性炭有利于降低褐化率，此结果与叶睿华等[12-13]在其他植物的试验结果相似。当活性炭添加量为1.0 g/L时，褐化率及褐化致死率相对较低。

表1 不同活性炭添加量东方草莓外植体的污染及褐化情况

未褐化或褐化程度不严重的茎尖，在接种21 d后，不经愈伤组织阶段而直接萌发新芽，最终形成丛生芽，从而获得东方草莓无菌苗。

2.2 不同浓度6-BA培养东方草莓的离体增殖情况

由表2看出，当6-BA的浓度为0.1～0.2 mg/L时，东方草莓长势健壮，但增殖倍数相对较低；当6-BA的浓度增加至0.3～0.4 mg/L时，增殖倍数随浓度的增加而增加，增殖苗健壮，叶色浓绿；当6-BA的浓度增加至0.5 mg/L时，增殖倍数开始下降，且增殖苗开始有黄化现象出现。当6-BA浓度增加至0.6 mg/L时，增殖倍数急剧下降，且苗低矮、皱缩畸形，黄化程度严重。在基本培养基为MS且NAA浓度为0.1 mg/L时，东方草莓离体增殖的最佳6-BA添加浓度为0.4 mg/L，其增殖倍数为11.26倍。

表2 不同浓度6-BA培养东方草莓无菌苗的增殖效果

2.3 不同基本培养基与生长素种类培养东方草莓的生根情况

从表3看出，当生长调节物为IBA时，接种21 d时，1/2 MS培养基和MS培养基的东方草莓无根试管苗生根率均达100%，高于NAA对根生长的诱导率；当生长调节剂为NAA，诱导生成的根普遍粗且健壮，平均根长相对较大，且单株诱导生根数更多，植株在出瓶练苗时更易成活；基本培养基为1/2 MS且NAA浓度为0.3 mg/L的培养基其株平均根数最多，为5.13根/株，平均根长也最长，为1.01 cm。

表3 不同基本培养基与生长素种类培养东方草莓的生根效果

虽然添加生根调节剂IBA时生根率达100%，但添加NAA生根调节剂诱导的不定根更粗、更健壮、长度更长。另外，观察发现，当诱导时间超过30 d时，添加NAA生根调节剂的培养基其诱导生根率也达100%。故此认为，诱导东方草莓无根试管苗生根的最佳培养基为1/2 MS+0.3 mg/L NAA。

3 讨论

野生草莓较现有栽培草莓具有较大优势，其抗病虫害、抗逆性更强，可溶性有机物种类更多，果实颜色更丰富，果实香味物质种类更多[1-8]。中国作为全球野生草莓的主要发源地之一，具有丰富的野生草莓资源，要利用好这些资源，就有必要对其进行详细的调查、搜集、整理和研究。野生东方草莓的抗寒性和抗旱性均很强，生长健壮，叶色浓绿，果实颜色深红，果肉绵软，香味独特，是一种优质的杂交育种资源，也可以通过染色体加倍、细胞融合或者转基因等方法进行育种，以使该优质基因源得到充分利用[12-17]。对野生东方草莓进行组织培养研究，建立其茎尖培养快繁体系，为其后续通过染色体加倍、细胞融合或转基因方法进行育种等工作奠定基础，也为其快繁探索道路，对其野生资源的开发、利用具有一定的现实意义，同时也为其他草莓属植物的组培快繁提供借鉴。

试验发现，剥取的茎尖外植体越小，其褐化率及褐化死亡率越高，相反，剥取的茎尖外植体越大，褐化程度越低且越有利于外植体成活，该结论与王军利等[3，15-16]的研究结论一致。由此可见，在草莓属植物组织培养时，其外植体切取越小，越容易褐化。6-BA对东方草莓离体增殖影响的研究发现，在一定范围内随着培养基中6-BA浓度增加，东方草莓离体增殖倍数增大，但达到某一峰值后，增殖倍数开始下降，与王军利等[3，15]的研究结论基本一致。在基本培养基和生长素对东方草莓无根苗生根的影响试验中发现，IBA作为添加的生长调节物，培养21 d时无根试管苗的生根率达100%；在添加IBA或NAA生长调节剂条件下，1/2MS培养基上无根试管苗生根时间都早于MS培养基，且生根量相对较大，长度较长，与王军利等[3，15]的研究结论一致。试验还发现，NAA作为生根调节剂，所生成的根普遍更粗、更健壮，该结论与王军利等[3]在五叶草莓上的研究结论一致，而与王燕等[15]对黄毛草莓的研究不一致。可见，同为草莓属植物，不同的种之间，试验结果有差异。因此，在构建不同植物的组织培养体系时，应针对具体植物而言，合适的培养基和添加剂应通过具体试验来取得和验证。

4 结论

通过离体茎尖培养，可建立野生东方草莓离体组培快繁体系，进而为其离体诱导及离体染色体加倍等育种工作提供前期材料和技术。野生东方草莓可利用其匍匐茎的茎尖在MS+0.4 mg/L 6-BA培养基上获得无菌苗，培养基中添1.0 g/L活性炭(AC)有利于预防外植体褐化；适合东方草莓快繁的培养基为MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其增殖倍数为11.26倍；适合其生根的培养基为1/2 MS+0.3 mg/L NAA，诱导根数多、根粗、根长，可获壮苗。