2型人类表皮生长因子受体基因对结直肠癌自然杀伤细胞92局部浸润的影响及机制

谭定春，秦惠何

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，近些年的发病率和死亡率均呈现上升趋势，严重威胁人类的生命健康。肿瘤的发生发展受肿瘤微环境中多种因素的调控，这些因素包括细胞内源性因子和外源性因素，如局部浸润的免疫细胞、肿瘤细胞分泌的促炎因子等。淋巴细胞是肿瘤微环境的重要组成成分，影响肿瘤的进展和预后，自然杀伤细胞（NK）是固有免疫细胞之一。结肠癌肿瘤组织中NK细胞数明显低于临近的正常组织，这说明肿瘤微环境中的调控因子不足以将NK细胞募集到肿瘤组织。2型人类表皮生长因子受体（HER2）是人类癌基因之一，在成人组织中几乎不表达，而在多种肿瘤中呈现高表达。有研究显示，结直肠癌中HER2表达升高，RNA干扰HER2表达可抑制癌细胞增殖；NK-92细胞联合靶向HER2基因的siRNA可抑制卵巢癌细胞在体内及体外增殖，提示HER2可能在NK细胞的局部浸润中发挥调控作用。NK92细胞与NK细胞具有相似的表面分子特征和功能特点，是一种理想的肿瘤生物治疗的细胞系。王洋研究显示，半乳糖凝集素-9（galectin-9）基因可通过影响NK92细胞F-肌动蛋白（F-actind）的极化，调节NK92细胞的趋化引动。目前，HER2对NK细胞局部浸润的影响还未知。鉴于此，本研究于2018年5—11月进行实验，旨在探讨HER2对结直肠癌NK细胞局部浸润的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

杜尔伯格伊戈尔培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）均购自美国Gibco；HER2和β-连环蛋白（β-catenin）抗体均购自美国CST；重组HER2购自美国R&D；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒购自中国碧云天；凝胶成像系统购自美国伯乐。

1.2 细胞及培养

人正常结肠上皮细胞（NCM460），人 结 直 肠 癌 细 胞（SW480、SW620、HT29）及人类NK92细胞均购自美国ATCC。NCM460、SW480、SW620和HT29细胞使用含10%FBS的DMEM培养基，NK92细胞用α最小必需培养基（α-MEM）完全培养基（含2 mmol L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠、12.5%FBS和马血清、0.02 mmol叶酸、0.2 mmol肌醇、100～200 U/mL重组IL-2和0.1 mmol 2-巯基乙醇），所有细胞均在5%体积分数二氧化碳、37℃恒温培养箱中培养。

1.3 Western blotting

预冷RIPA裂解液（加蛋白酶抑制剂PMSF）提取生长至对数期的SW480、SW620和HT29细胞总蛋白，BCA试剂盒定量蛋白，蛋白变性后，每孔加40 μg上样，依次经10%SDSPAGE、转PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，洗膜，将膜完全浸入按照1∶500稀释的HER2及1∶1 000稀释的内参GAPDH溶液中，4℃摇床孵育过夜，洗膜，加1∶2 000稀释的HRP标记的二抗，室温孵育30～50 min，洗膜，ECL显色，显影、定影，待胶片晾干后扫描分析。使用Image J分析软件对图像进行灰度值分析。得出目的蛋白与内参蛋白光密度值比值，即为蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.4 转染

以1×10/孔接种生长至对数期的HT29细胞于6孔细胞培养板，每孔2 mL，使其在24 h内细胞达70%～80%生长汇合度，参照Lipofectamine2000说明制备Lipo-2000-siRNA复合物，其中siRNA包括阴性对照siRNA及HER2的特异性siRNA，将复合物加入培养孔中，设置加等体积脂质体的空白组，轻轻混匀，37℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱，常规孵育4～6 h，更换含血清及双抗的培养基，继续培养48 h，然后进行后续实验。siRNA序列如下：HER2 siRNA正向引物5'-CUGGUGUAUGCAGAUUGCCUU-3'，反向引物5'-GGCAAUCUGCAUACACCAGUU-3'；阴 性 对 照siRNA正 向 引 物5'-CUUGUAUGGGCAGAUUGCCUU-3'，反向引物5'-GGCAAUCUGCCCAUACAAGUU-3'。

1.5 HT29细胞培养上清HER2的含量

HER2的特异性siRNA转染HT29细胞48 h，收集肿瘤细胞培养上清，采用ELISA试剂盒检测上清中HER2的含量。

1.6 趋化实验

将100 μL的NK92细胞（浓度2×10/mL）置于Transwell小室上层，Transwell小室下层加25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的rhHER2或600 μL的HT29细胞培养上清，将培养板放于37℃孵箱中4 h，用于趋化实验。收集下室细胞使用细胞计数板计数。应用趋化指数（MI）评估：MI=趋化细胞数/自发趋化细胞数（无趋化因子）。此外，使用7.5 ng/mL的IL-12作为NK细胞趋化作用的阳性对照。

2 结果

2.1 三株结直肠癌细胞HER2基因表达

以正常结肠NCM460细胞为对照细胞，Western blotting检测结直肠癌SW480、SW620和HT29细胞HER2蛋白表达，结果如图1所示。

图1 SW480、SW620和HT29细胞HER2的蛋白表达

三株结直肠癌细胞HER2蛋白表达均明显高于NCM460细 胞［（0.104±0.011）、（0.141±0.015）、（0.243±0.018）比（0.018±0.003），

F

=153.526，

P

＜0.05］，由于在HT29细胞表达最高，因此选择HT29细胞为后续研究对象。

2.2 HER2小干扰RNA转染HT29细胞效果

转染si-HER2的HT29细胞HER2蛋白表达［（0.467±0.046）、（0.506±0.053）比（0.101±0.012），

F

=88.628，

P

＜0.05］及培养上清HER2含量［（74.7±4.6）pg/mL比（125.3±10.1）pg/mL、（121.6±9.3）pg/mL，

F

=34.153，

P

＜0.05］均明显低于对照组和NC组。见图2。

图2 Western blotting检测转染si-HER2的HT29细胞HER2蛋白表达

2.3 重组HER2对NK92细胞趋化运动的影响

25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的重组HER2处理NK92细胞4 h，IL-12作为阳性对照，细胞趋化检测结果显示，与对照组比较，IL-12组迁移指数明显升高［（1.00±0.10）比（2.26±0.24），

P

＜0.05］，而100 ng/mL重组HER2组迁移指数明显降低［（1.00±0.10）比（0.63±0.09），

P

＜0.05］。25 ng/mL和50 ng/mL的重组HER2组迁移指数与对照组差异无统计学意义［（1.00±0.10）比（1.11±0.12）、（1.04±0.15），

P

＞0.05］。

2.4 抑制HER2表达对NK92细胞趋化运动的影响

si-HER2转染HT29细胞后，收集肿瘤上清对NK92细胞进行趋化实验，结果显示，与对照组、NC组比较，si-HER2组迁移指数明显升高［（1.00±0.11），（1.37±0.10）比（1.95±0.16），

F

=43.264，

P

＜0.05］。

2.5 重组HER2对NK92细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的重组HER2处理NK92细胞4 h，IL-12作为阳性对照，Western blotting检测NK92细胞中β-catenin蛋白表达，结果如图3所示。与对照组比较，IL-12组βcatenin蛋白水平明显降低［（0.687±0.059）比（0.312±0.025），

P

＜0.05］，而100 ng/mL重 组HER2组βcatenin蛋白水平明显升高［（0.687±0.059）比（1.118±0.097），

P

＜0.05］。25 ng/mL和50 ng/mL的 重 组HER2组β-catenin蛋白水平与对照组差异无统计学意 义［（0.687±0.059）比（0.692±0.061），（1.118±0.097），

P

＞0.05］。

图3 各组NK92细胞β-catenin蛋白表达条带

2.6 抑制HER2对NK92细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

si-HER2转染HT29细胞后，收集肿瘤上清，Western blotting检测β-catenin蛋白表达，结果如图4所示，si-HER2组β-catenin蛋白表达明显低于对照组和NC组（0.687±0.059），（0.651±0.052）比（0.092±0.011），

F

=158.849，

P

＜0.05］。

图4 HER2对NK92细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

3 讨论

NK细胞是固有免疫系统的主要细胞之一，可识别和杀伤肿瘤细胞，在肿瘤的免疫监视中起重要作用。研究显示，结直肠癌肿瘤组织中淋巴细胞大量浸润的病人预后较好，原因与NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤作用密不可分。NK92细胞是一种NK细胞，与人NK细胞具有相似的表面分子特征和功能特点，对血液系统肿瘤、黑素瘤等具有很强的杀伤活性，且不引起自身正常细胞损伤，是目前认为的一种理想的可用于肿瘤生物治疗的细胞系。

HER2是一种由原癌基因表达的跨膜糖蛋白，可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和血管生成，抑制肿瘤细胞的凋亡。研究显示，HER2在结直肠癌组织中的表达水平明显高于正常组织，其表达水平与肿瘤浸润深度密切相关，可作为判断结直肠癌发生、发展、浸润及转移的有效生物学指标。本研究结果显示，结直肠癌细胞系中HER2蛋白表达明显高于正常结肠细胞，与相关研究结果一致，提示HER2参与结直肠癌的发生和发展；研究显示，激活HER2-ERK1/2信号转导途径可促进乳腺癌MCF-7细胞的迁移和侵袭；HER2靶向NK细胞可用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌。本研究结果显示，重组HER2可降低NK92细胞的趋化运动，而抑制HER2表达后NK92细胞趋化运动明显升高，说明抑制HER2表达可增强结直肠癌NK92细胞趋化运动。

Wnt/β-catenin是细胞内一条重要的信号途径，与多种肿瘤发生发展密切相关。研究表明，抑制Wnt/β-catenint通路可降低肿瘤细胞生长、侵袭、迁移。β-catenin是Wnt/β-catenint信号的关键分子，研究显示，NK细胞对非小细胞肺癌细胞NCI-H292具有杀伤作用，并可抑制β-catenin蛋白表达。本研究结果显示，HER2表达受到抑制后，NK92细胞中β-catenin蛋白表达明显降低，而重组HER2则会促进NK92细胞中β-catenin蛋白表达，提示抑制HER2表达可能通过下调Wnt/β-catenin信号通路增强结直肠癌NK细胞的趋化运动，进而增加结直肠癌NK细胞局部浸润。

综上所述，抑制HER2基因表达可增强结直肠癌NK92细胞局部浸润，机制与下调Wnt/β-catenin信号有关。提示HER2可能是结直肠癌治疗的有效靶点之一。