舒芬太尼调控miR-1抑制肝癌细胞MHCC97-H增殖、侵袭和迁移的机制研究

曹峰，刘敏,赵潇

肝细胞癌是最常见的类型，占肝癌的70%～85%。外科手术仍是肝癌的主要治疗措施，早期肝癌病人通过手术治疗，如切除部分肝脏或移植，病人5年存活率超过70%。然而，大多数中晚期肝癌病人5年生存率约为15%。近期研究显示，在围术期使用的麻醉剂能够影响病人预后及肿瘤复发。在围术期有效抑制肿瘤细胞生长和转移是临床医学研究的热点。

舒芬太尼是临床上常用的麻醉诱导和辅助麻醉剂，其属于苯基哌啶类强效阿片类药物。目前关于舒芬太尼对肝癌细胞侵袭和迁移影响的研究鲜有报道，并且其作用机制尚不明确。多项研究指出微小RNA-1（microRNA-1，miR-1）在人类多种恶性肿瘤，如结直肠癌、前列腺癌和膀胱癌等中表达下调。有关报道显示，miR-1能够抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡。近期有研究显示，舒芬太尼可通过调控miR-1对大鼠心肌缺血再灌注损伤起保护作用。提示舒芬太尼可能对miR-1的表达具有调控作用。

本研究起止时间为2018年3月至2019年9月，通过观察舒芬太尼对人肝癌MHCC97-H细胞增殖、侵袭和迁移及miR-1表达的影响，探究舒芬太尼对肝癌细胞影响的机制，以期为舒芬太尼在肝癌治疗中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞株MHCC97-H购自中国科学院上海细胞研究所；枸橼酸舒芬太尼注射液购自宜昌人福药业有限公司；杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养基购自美国Hyclon公司；胰蛋白酶和新生小牛血清购自美国Gibco公司；Cell Counting Kit（Cell Counting Kit-8，CCK-8）试剂购自日本同仁研究所；Trizol试剂购自美国Ambion公司；逆转录试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-1抑制剂（inhibitor）和阴性对照均购自广州锐博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Corning公司；基质胶（Matrigel）购自美国BD公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒、放射免疫沉淀法（RIPA）细胞裂解试剂、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所；鼠抗人基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）单抗及辣根过氧化酶标记山羊抗鼠IgG均购自美国CST公司；实验所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 细胞培养

人肝癌细胞MHCC97-H常规复苏后培养在含10%灭活小牛血清的DMEM培养基中，加入100 μg/mL青霉素-链霉素，放入体积分数为5%二氧化碳、37℃恒温培养箱中，细胞贴壁生长，每隔2天换液1次，待细胞生长密度达80%以上时，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，按照1∶3或1∶4的比例进行传代培养。

1.3 CCK-8检测舒芬太尼对MHCC97-H细胞活力的影响

对数期的MHCC97-H细胞以胰酶消化，计数后取100 μL细胞悬液加入到96孔板中，每孔约5×10个细胞，放置在37℃培养箱继续培养，待细胞贴壁后，弃去就培养液，加入含不同浓度（0、0.01、0.1、1、10、20 μmol/L）舒芬太尼的培养液，分别孵育24、48、72 h，在各个时间点向细胞中加入CCK-8溶液20 μL，继续孵育4 h，使用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值（optical density，OD），分别计算各组MHCC97-H细胞活力，细胞活力（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4 细胞分组和处理

对数生长期的MHCC97-H细胞接种到6孔板中，接种密度为2×10个/孔，于37℃培养箱继续培养，将细胞随机分为4组：对照（Control）组即未做任何处理的MHCC97-H细胞；舒芬太尼（Sufentanil）组即1 μmol/L舒芬太尼干预的MHCC97-H细胞；舒芬太尼和转染（Sufentanil+miR-1）组即转染miR-1 inhibitor后施加1 μmol/L舒芬太尼干预的MHCC97-H细胞；舒芬太尼和对照（Sufentanil+NC）组即转染阴性对照后施加1 μmol/L舒芬太尼干预的MHCC97-H细胞。细胞转染严格参照Lipofectamine 2000转染试剂使用说明书进行操作，各组MHCC97-H细胞处理48 h后进行相应指标检测。

1.5 qRT-PCR检测

各组MHCC97-H细胞处理48 h后，收集细胞，采用Trizol试剂分别提取MHCC97-H细胞中总RNA，使用Nanodrop超微量核酸蛋白检测仪测定RNA的丰度和纯度。选择合格的RNA进行逆转录，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板，以U6为内参，采用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行PCR扩增，反应程序设为：94℃预变性5 min，共1个循环；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40个循环。反应结束后获取Ct值，并采用相对定量2法分别计算各组MHCC97-H细胞中miR-1相对表达量。所用引物：miR-1 5’-TAGAAGCTTGCCTCTGAGCTGCCTTCTCTA-3’。U6 F-5’-CTTCGGCACGCACATATAC-3’；R-5’-GAACGCTTCACGAATTTGC-3’。

1.6 Western blotting检测

各组MHCC97-H细胞弃去培养液，用预冷的PBS洗涤细胞3次，用细胞刮刮下细胞，收集细胞，加入配置好的RIPA细胞裂解液，于冰上裂解细胞，离心后收集上清即总蛋白。分别配制12%分离胶和4%浓缩胶，取40 μg蛋白样品分别加入到每个泳道中，调整电压行SDS-PAGE电泳。电泳结束后断开电源，将凝胶上的蛋白采用半干法电转至PVDF膜上，于5%小牛血清的封闭液中孵育2 h，TBST冲洗膜3次，分别加入1∶500稀释的一抗，冰上过夜孵育，TBST冲洗膜3次，再加入1∶3 000稀释的二抗，室温孵育2 h，TBST冲洗膜3次，化学发光显影，采用成像系统采集图像，使用Image J软件分析图像中的各条带灰度值，以β肌动蛋白（β-actin）进行标定，计算各组MGC-803细胞中MMP-2和MMP-9蛋白相对表达水平。

1.7 Transwell实验

以胰酶消化各组MHCC97-H细胞，离心收集并将细胞密度调整至2×10个/毫升。取200 μL细胞悬液加入到Matrigel基质胶包被的Transwell小室的上室，在下室加入含10%小牛血清的培养液600 μL，放置在37℃培养箱中常规培养48 h。取出小室后弃去培养液，使用棉签轻轻擦去上室未穿膜的细胞和基质胶，经无水甲醇固定后，漂洗晾干，再使用0.1%结晶紫染色，以PBS洗涤3遍，使用倒置显微镜（400倍）观察，随机选取5个视野观察并进行计数穿膜细胞数。

1.8 划痕实验

将各处理组MHCC97-H细胞以1×10个/平铺于6孔板上，在常规培养箱中继续培养，待细胞呈单层汇合时，用无菌移液枪枪头垂直划线，用PBS洗去划下的细胞，加入不含血清的培养液，在37℃培养箱继续培养48 h，分别在0和48 h在光镜下观察并记录细胞划痕距离。分别计算各组MHCC97-H细胞的迁移率，细胞迁移率（%）=（0 h划痕距离-48 h划痕距离）×100%。

2 结果

2.1 舒芬太尼对肝癌MHCC97-H细胞活力的影响

CCK-8检测不同浓度舒芬太尼干预24、48、72 h对肝癌MHCC97-H细胞活力的影响，随着舒芬太尼浓度的升高MHCC97-H细胞活力随之下降，在干预24 h时，舒 芬 太 尼 的 浓 度 达 到10 μmol/L时MHCC97-H细胞活力降低（

P

＜0.05），在干预48 h时，舒芬太尼的浓度达到1 μmol/L时细胞活力降低（

P

＜0.05）。基于该实验筛选出舒芬太尼干预MHCC97-H细胞最适作用浓度为1 μmol/L，最适作用时间为48 h。见表1。

表1 不同浓度的舒芬太尼对肝癌MHCC97-H细胞活力的影响/±s

2.2 各组MHCC97-H细胞miR-1表达比较

在MHCC97-H细胞转染miR-1 inhibitor后采用1 μmol/L舒芬太尼进行干预，qRT-PCR检测结果显示，Sufentanil组MHCC97-H细胞中miR-1的表达水平（2.25±0.24）高 于Control组（1.00±0.09）（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1组MHCC97-H细 胞 中miR-1的 表达 水 平（1.42±0.15）低 于Sufentanil+NC组（2.20±0.21）（

P

＜0.05）；而Sufentanil组和Sufentanil+NC组中miR-1的表达水平差异无统计学意义（

P

＞0.05）。

2.3 各组MHCC97-H细胞增殖能力比较

CCK-8实验结果显示，Sufentanil组MHCC97-H细胞OD值（0.34±0.03）明 显 低 于Control组（0.54±0.05）（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1组MHCC97-H细 胞OD值（0.46±0.04）明显高于Sufentanil+NC组（0.32±0.03）（

P

＜0.05）；而Sufentanil组和Sufentanil+NC组细胞OD值差异无统计学意义（

P

＞0.05）。

2.4 各组MHCC97-H细胞侵袭和迁移能力比较

Transwell实验结果显示，Sufentanil组侵袭细胞数明显少于Control组（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1组侵袭细胞数明显多于Sufentanil+NC组（

P

＜0.05）。划痕实验结果显示，Sufentanil组细胞迁移率明显低于Control组（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1组细胞迁移率明显高于Sufentanil+NC组（

P

＜0.05）。见表2。

表2 各组MHCC97-H细胞侵袭细胞数和细胞迁移率比较/±s

2.5 各 组MHCC97-H细 胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平比较

Western blotting检测结果显示，Sufentanil组MHCC97-H细胞 中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平低于Control组（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1组MHCC97-H细 胞中MMP-2和MMP-9蛋 白表达水平明显低于Sufentanil+NC组（

P

＜0.05）；而Sufentanil组 和Sufentanil+NC组 细 胞 中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见图1和表3。

图1 Western blotting检测各组MHCC97-H细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平

表3 各组MHCC97-H细胞中MMP-2和MMP-9表达水平比较/±s

3 讨论

舒芬太尼常做麻醉辅助药物用于癌症手术中，近年来，舒芬太尼等阿片类药物对肿瘤转移和复发等影响受到国内外研究者的广泛关注。但关于其对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响亟待研究。因此，本研究采用不同浓度的舒芬太尼干预人肝癌MHCC97-H细胞，CCK-8实验结果显示，不同浓度的舒芬太尼对MHCC97-H细胞活力具有不同程度的抑制作用。基于CCK-8实验结果筛选出最适作用浓度1 μmol/L和最适作用时间48 h，以用于后续实验加药标准浓度及处理时间。此外本实验qRT-PCR检测结果发现，舒芬太尼处理后MHCC97-H细胞中miR-1的表达水平明显升高，这与Qiao等人的研究相似，提示舒芬太尼可能调控miR-1的表达。

miR-1能够参与调控人类多种恶性肿瘤的发生和进展。Xie等报道指出，miR-1在胃癌组织和细胞系中的表达明显降低，在胃癌细胞中过表达miR-1能够抑制内皮细胞的增殖、迁移和血管形成，起到肿瘤抑制剂的作用。另一项研究指出，miR-1在卵巢癌组织中表达下调，并且可能通过抑制c-Met表达抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭。在肝癌中，miR-1亦呈低表达，且miR-1可能通过抑制死亡结构域沉默子（BAG4）的表达诱导肝癌Hep3B细胞发生凋亡。为探究舒芬太尼通过调控miR-1的表达影响肝癌MHCC97-H细胞体外增殖、侵袭和迁移能力，本研究通过脂质体转染技术将miR-1 inhibitor转染至MHCC97-H细胞下调miR-1的表达。CCK-8、Transwell实验和划痕实验结果发现，舒芬太尼能够抑制MHCC97-H细胞增殖、侵袭和迁移，而下调miR-1的表达能够部分逆转舒芬太尼诱导的细胞增殖、侵袭和迁移抑制作用。本研究表明，舒芬太尼可能通过调控miR-1的表达来影响MHCC97-H细胞增殖、侵袭和迁移。

肿瘤转移是一个极其复杂的过程，包括肿瘤细胞从原发肿瘤部位脱离，侵犯周围正常组织，并转移到远处部位继续增殖形成继发瘤。在该过程中，细胞外基质被降解，血管基底膜被破坏，这些均与基质金属蛋白酶密切相关。MMP-2和MMP-9均属于基质金属蛋白酶家族重要成员，其主要功能是降解细胞外基质蛋白成分。研究显示，MMP-2和MMP-9表达量与肿瘤细胞侵袭和迁移能力呈正相关。本研究通过Western blotting检测发现，舒芬太尼干预的MHCC97-H细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达降低，而下调miR-1的表达后MMP-2和MMP-9蛋白表达水平可部分恢复。表明舒芬太尼通过抑制miR-1的表达对MHCC97-H细胞侵袭和迁移能力的抑制作用可能通过下调MMP-2和MMP-9的表达实现的。

综上，本研究发现舒芬太尼能够抑制肝癌MHCC97-H细胞增殖、侵袭和迁移，其作用机制可能与抑制MHCC97-H细胞中miR-1的表达有关。