不同剂量雷公藤多苷对寻常型银屑病样小鼠血清炎性因子的影响

宋颖，朱世文，王晓馨

银屑病是一种慢性、免疫介导的疾病，全世界约1亿人受其影响。从组织学方面讲，角质形成的细胞增殖、表皮网状角化过度和表皮增厚都能引起银屑病。尽管银屑病的确切病因尚不清楚，但是越来越多的研究表明，炎性细胞因子和趋化因子的产生会促进疾病的发展，因此抗炎成为治疗银屑病的一种有效方式。其中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-17（IL-17）、白细胞介素-23（IL-23）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和核转录因子-κB（NF-κB）等细胞因子在银屑病的发生发展过程中具有重要作用。

在银屑病等皮肤疾病治疗过程中，天然产物备受青睐，雷公藤多苷（Tripterygium glycosides）的多种生物活性受到广泛关注和研究。雷公藤多苷是源于雷公藤根的一种脂溶性混合物，可影响炎症过程和免疫疾病，因此具有抗炎和免疫调节等作用。但雷公藤多苷的标准提取物较为单一，可能会引起较为严重的临床不良反应，导致其在治疗银屑病时没有标准用量。本研究通过观察不同剂量雷公藤多苷对银屑病样小鼠血清炎性因子的影响，探讨其最佳治疗剂量，为病人合理用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

40只雄性BALB/c小鼠（18～20 g）由陕西中药研究所［SYXK（陕）2016-003］提供，研究时间为2019年2—11月。雷公藤多苷片由浙江得恩德制药有限公司生产；咪喹莫特（IMQ）乳膏由珠海联邦制药股份有限公司生产。ELISA试剂盒购于Sigma；超氧化物歧化酶（SOD）活性测试试剂盒和谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平测定试剂盒购买于Biovision；抗TNF-α和NF-κB一抗和二抗购买于Sino Biological；HaCat细胞购买于中科院细胞库；DMEM培养基、10%胎牛血清和青链霉素双抗购买于Thermo。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模将40只BALB/c雄性小鼠置于动物饲养室饲养，饲养环境为实验动物生长的标准环境，用标准啮齿类动物饲料进行喂养，适应性饲养3 d后将小鼠编号并采用随机数字表法分为五组：对照组，模型组，低、中、高剂量给药组，每组8只。采用IMQ诱导进行寻常型银屑病造模：小鼠连续7 d接受每天62.5 mg的5% IMQ乳膏涂抹在其背部3 cm×2.5 cm的剃毛区域，而模型组在剃毛后则涂抹等量凡士林，对照组仅剃毛，不做任何处理。造模成功后，给药组分别灌胃10 mg·kg·d、20 mg·kg·d和40 mg·kg·d的雷公藤多苷，连续灌胃14 d。

1.2.2 细胞造模将复苏后的细胞正常培养及传代，选择生长旺盛、形态良好的细胞接种于24孔板上，每孔加入1.5 mL的完整培养基培养24 h，待细胞贴壁后，分别加入浓度为50 μg/L的γ-干扰素（IFN-γ）和10 μg/L的IL-6刺激因子刺激细胞48 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.3 细胞培养HaCat细胞分为四组：对照组，以及低、中、高剂量给药组。细胞培养在完全培养基中（DMEM+10%胎牛血清+青链霉素双抗），给药组的培养基中分别加入浓度梯度为10 mg/L、20 mg/L及40 mg/L的雷公藤多苷，细胞培养瓶置于37℃、二氧化碳浓度为5%的培养箱中培养。

1.2.4 小鼠皮肤组织SOD活性及GSH和MDA水平测定灌胃14 d后收集皮肤组织在Tris缓冲液（20mmol/L，pH 7.5）中均质化，然后12 000 r/min离心10 min收集上清液。所有操作均在4℃环境中进行。上清液用于SOD活性及GSH和MDA水平测定。以牛血清蛋白为标准，通过Bradford方法测定上清液中蛋白质的浓度。所有测定实验严格按照试剂盒说明书进行，重复3次。

1.2.5 ELISA分析所有小鼠在灌胃14 d后用3%戊巴比妥钠溶液麻醉。腹腔静脉取全血，分离血清，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定IL-1、IL-6、IL-18和IL-23水平。所有测定实验严格按照试剂盒说明书进行，重复3次。

1.2.6 蛋白质印迹法从收集到的小鼠全血和病变皮肤中获得总蛋白样品，在4℃离心机中12 000 r/min离心5 min。蛋白样品通过十二烷基磺酸纳一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在80 V下电泳0.5 h，在120 V下电泳1.5 h。分离的蛋白质转移到PVD膜上30 min。用含有0.1%的吐温20缓冲液孵育1 h后，用抗TNF-α和NF-κB一抗在4°C下孵育过夜。缓冲液洗涤3次后，用辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1 h。显影拍照后用使用Image J软件分析图像。

1.2.7 流式细胞术检测各组细胞的周期变化细胞培养48 h后，采用不含EDTA的0.25%胰酶消化处理，终止消化后，于1 500 r/min离心处理5 min，然后收集细胞。PBS液洗涤细胞沉淀2次，加入预冷的70%甲醇1 mL，于4℃环境下固定4 h。然后再加入含有100 mg/L RNase A的PBS液500 μL，于37℃环境孵育30 min，完成后，再加入PI调整浓度为50 mg/L。避光37℃孵育30 min。取200 μL的单细胞悬液，流式上机检测。

2 结果

2.1 雷公藤多苷调节小鼠病变皮肤组织中SOD活性及GSH和MDA水平

结果显示（表1），与对照组比较，模型组小鼠的GSH水平和SOD活性均显著降低（

P

=0.002；

P

=0.007），给药组的GSH水平和SOD活性高于模型组，其中中剂量组最高（

P

＜0.001，

P

=0.003），低剂量组最低（

P

=0.004；

P

=0.037）；模型组小鼠MDA水平高于对照组（

P

＜0.001），经过药物治疗处理后MDA水平降低（

P

＜0.001）。这些结果表明，20 mg·kg·d的雷公藤多苷可以明显抑制MDA水平，可以有效调节IMQ诱导的小鼠体内的氧化/抗氧化状态，从而达到更有利的生理平衡。

表1 小鼠病变皮肤组织中SOD活性及GSH和MDA水平/±s

2.2 ELISA分析 小鼠血 清IL-6、IL-17、IL-23和

TNF-α

结果显示（表2），模型组小鼠血清中IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α水平相较于对照组升高（

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

=0.011），表明IMQ诱导的银屑病可引起小鼠血清炎性因子升高；而低剂量组的IL-17和TNF-α表达水平与模型组相比差异无统计学意义（

P

=0.068，

P

=0.98），中剂量组和高剂量组小鼠血清炎性因子下降（

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

=0.041）。

表2 银屑病样小鼠血清中炎性因子表达水平/（pg/mg，±s）

2.3 Western blotting分析小鼠皮肤中NF-κB水平

Western blotting分析雷公藤多苷对NF-κB蛋白表达影响的结果表明（图1），模型组小鼠的NF-κB表达水平相较于对照组升高（

P

＜0.001），而各个给药组的小鼠NF-κB表达水平发生降低（

P

=0.005），且中剂量组的抑制效果最佳（

P

＜0.001）（图1）。

图1 Western blotting检测小鼠病变皮肤中NF-κB表达水平

2.4 不同剂量雷公藤多苷对各组细胞周期的影响

流式细胞术检测各组细胞的周期变化情况结果表明（表3），与对照组相比，低剂量组（10 mg/L）雷公藤多苷处理48 h的HaCat细胞的G1期细胞所占比例差异无统计学意义（

P

=0.3），而中剂量组（20 mg/L）和高剂量组（40 mg/L）雷公藤多苷处理48 h后细胞G1期细胞所占比例升高（

P

＜0.001，

P

=0.013），即细胞阻滞在G1期。

表3 不同剂量雷公藤多苷对各组小鼠组织细胞周期的影响/（%，±s）

3 讨论

银屑病的治疗一直是皮肤病领域重要的问题和研究热点。本研究结果表明，IMQ诱导的寻常型银屑病样小鼠的MDA水平升高，同时GSH水平和SOD活性降低，这表明氧化应激在银屑病发病机制中起关键作用。而雷公藤多苷处理导致给药组小鼠SOD活性增加，GSH水平上升和MDA水平下降，这表明，雷公藤多苷可通过抗氧化机制抑制银屑病的发展。同时我们发现，中剂量（20 mg·kg·d）灌胃组的抗氧化效果最好，高剂量（40 mg·kg·d）灌胃组的小鼠抗氧化效果略有下降。

研究表明，T细胞介导了银屑病的发生；几种全身性促炎细胞因子（IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α）也是银屑病的主要参与者。乔菊等研究表明，银屑病病人的组织和血清中TNF-α、IL-17A、IL-23和IL-36γ水平升高；其中TNF-α不仅增加了其他促炎细胞因子的产生，还诱导了NF-κB的产生并影响细胞的增殖和存活。研究表明，在牛皮癣病人的皮肤和血清中，IL-6水平显著增加，这说明IL-6是潜在用于治疗牛皮癣的靶标细胞因子。IL-17能诱导人皮肤角质细胞中形成IL-6、IL-8和CXCL5，间接促进嗜中性粒细胞的分化、活化和迁移。因此，在本研究中检测了细胞因子TNF-α、IL-6、IL-17和IL-23的变化趋势。结果表明，用不同剂量的雷公藤多苷灌胃小鼠后，上述几种细胞因子表达水平显著降低，小鼠的炎症状态得到了有效改善；但低剂量组的小鼠血清细胞因子没有明显变化，剂量升高后细胞因子水平才发生显著下降。Western blotting结果也表明，雷公藤多苷可以抑制NF-κB的表达水平。

本研究的实验结果与高军等研究结果一致，雷公藤多苷可抑制寻常银屑病样小鼠血清NF-κB的表达水平，从而对T细胞的活化与增殖产生抑制作用。而T细胞在银屑病的发病机制中起着重要作用。IL-23/Th17通路被认为是银屑病发病的中心，而TNF-α和IL-17可根据其作用方式分为调节性和效应性细胞因子。同时TNF-α和IL-6的表达又受到NF-κB的调控，因此NF-κB可能是雷公藤多苷影响寻常型银屑病样小鼠促炎细胞因子的关键因子。研究表明，雷公藤多苷导致的抗增殖、促凋亡、抗炎作用与其抗银屑病作用有关。因此我们通过流式细胞术检测其对各组细胞周期的影响。结果表明，雷公藤多苷处理细胞后，会将银屑病模型细胞的细胞周期阻滞在G1期。这表明，雷公藤多苷可通过抑制细胞增殖而抑制银屑病的发展，这可能与雷公藤多苷抑制Wnt/Frizzled信号传导通路有关。

综上所述，雷公藤多苷通过调节细胞周期和促炎细胞因子改善了IMQ诱导的小鼠牛皮癣样皮肤损伤的严重程度，而抑制NF-κB可能是雷公藤多苷影响寻常型银屑病小鼠促炎细胞因子的关键步骤，当然这还需进一步实验验证。同时实验结果表明，雷公藤多苷抗银屑病的有效剂量在20～40 mg·kg·d，但还需进一步研究以确定其临床最佳使用剂量。