长链非编码小核仁RNA宿主基因7调控微小RNA-331-3p表达影响甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

常晓苗

近年来出现的靶向治疗是甲状腺癌新型治疗手段，为难治性甲状腺癌的治疗提供了广阔前景。研究发现长链非编码RNA（lncRNA）、微RNA（miRNA）均可作为甲状腺癌早期诊断和预后的生物标志物以及靶向治疗的新靶点。研究发现长链非编码小核仁RNA宿主基因7（lncRNA SNHG7）在膀胱癌组织和细胞中过表达，下调lncRNA SNHG7可以抑制膀胱癌细胞的恶性生物学行为。沉默lncRNA SNHG7可抑制Fas凋亡抑制分子2（FAIM2）蛋白水平，抑制细胞增殖，迁移和侵袭，加速肺癌细胞凋亡。微小RNA-331-3p（miR-331-3p）促进肝细胞癌的增殖和转移。miR-331-3p在结直肠癌组织和细胞中下调表达可抑制增殖并促进细胞凋亡。但lncRNA SNHG7和miR-331-3p对甲状腺癌的发生发展影响还尚未清楚。本研究旨在研究lncRNA SNHG7和miR-331-3p对甲状腺癌发生发展的影响及SNHG7是否调控miR-331-3p。

1 资料与方法

1.1 一般资料

人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1和人甲状腺癌细胞K1、BCPAP、TPC-1购自中国科学院上海细胞库；RPMI-1640培养基（美国Gibico公司）；荧光定量PCR试剂盒（日本TaKaRa）；Transwell小室、基质胶（美国BD公司）；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒、放射免疫沉淀分析（RIPA）蛋白裂解液盒（上海碧云天）。本研究起止时间为2018年1月至2019年2月。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1和人甲状腺癌细胞K1、BCPAP、TPC-1用RPMI-1640培养基于37℃、5%二氧化碳条件下培养；取对数生长期细胞TPC-1，将其分为si-NC组（转染SNHG7干扰表达载体阴性对照）、si-SNHG7组（转染SNHG7干扰表达载体）、pcDNA组（转染SNHG7过表达载体阴性对照）、pcDNA-SNHG7组（转染SNHG7过表达载体）、si-SNHG7+anti-miR-NC（共转染SNHG7干扰表达载体和miR-331-3p抑制剂阴性对照）、si-SNHG7+anti-miR-331-3p组（共转染SNHG7干扰表达载体和miR-331-3p抑制剂）；正常培养的细胞作为空白对照组。

1.2.2 qRT-PCR检测miR-331-3p和SNHG7 mRNA表达水平提取Nthy-ori 3-1和人甲状腺癌细胞K1、BCPAP、TPC-1以及各组TPC-1细胞的总RNA，合成cDNA后进行PCR扩增，相对表达量采用2法计算。miR-331-3p正 向 引 物：5′-AGGCCCCTGGGCCTATC-3′，反向引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6正 向 引 物：5′-CGCTTCGGCACATATAC-3′，反 向 引 物：5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。SNHG7正向引物：5′-ACTAAGCCCTCCTGTGCAAC-3′，反 向 引 物：5′-TCCCAGATACCAGCGAAGGA-3′，产物长度为298 bp；GAPDH正向引物：5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，反向引物：5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′，产物长度为154 bp。

1.2.3 Western blot检测蛋白的表达提取各组TPC-1细胞的总蛋白，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜，5 %脱脂奶粉封闭1 h，加入细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21）、神经钙黏蛋白（Ncadherin）、上皮钙黏蛋白（E-cadherin）一抗孵育过夜，加入山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶（HRP）二抗室温孵育2 h，显影，定影，测定各组蛋白条带的吸光度，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参。

1.2.4 MTT检测细胞增殖各组细胞培养24 h、48 h、72 h时，按试剂盒说明操作，检测490 nm处吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭迁移实验：将无血清重悬的100 μL细胞接种于Transwell上室，培养24 h，0.1%结晶紫染色后显微镜下随机选取5个视野计数。侵袭实验：将基质胶平铺于Transwell上室，其余同迁移操作。

1.2.6 荧光素酶报告基因检测实验检测SNHG7对miR-331-3p的靶向调控构建SNHG7野生型荧光素酶载体（WT-SNHG7）和SNHG7突变型荧光素酶表达载体（MUT-SNHG7），将WT-SNHG7和MUT-SN-HG7分 别与miR-NC和miR-331-3p共 转染TPC-1细胞，按试剂盒说明书检测。

2 结果

2.1 SNHG7与miR-331-3p在甲状腺癌细胞系中的表达情况

与人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1相比，人甲状腺癌细胞K1、BCPAP、TPC-1中SNHG7的表达水平显著升高；miR-331-3p的表达水平显著下降，差异有统计学意义（

P

＜0.05），见表1。

表1 SNHG7与miR-331-3p在甲状腺癌细胞系中的表达情况/xˉ±s

2.2 干扰SNHG7表达对甲状腺癌TPC-1细胞增殖的影响

与si-NC组相比，si-SNHG7组TPC-1细胞中Cyclin D1蛋白的表达水平显著降低，p21的表达水平显著升高，TPC-1细胞活性显著降低（

P

＜0.05）；干扰SNHG7表达抑制甲状腺癌TPC-1细胞增殖，见图1，表2。

表2 干扰SNHG7对TPC-1细胞增殖的影响/xˉ±s

图1 Western blotting法检测干扰SNHG7后CyclinD1、p21蛋白的表达

2.3 干扰SNHG7对TPC-1细胞迁移、侵袭的影响

与si-NC组相比，si-SNHG7组E-caherin的表达水平升高，N-cadherin表达水平降低，且迁移和侵袭细胞数降低（

P

＜0.05）。干扰SBF2-AS1表达抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移、侵袭。见表3。

表3 干扰SNHG7表达对TPC-1细胞迁移侵袭的影响/xˉ±s

2.4 SNHG7靶 向 调 控miR-331-3p

TargetScan预测到SNHG7与miR-331-3p存在结合位点。miR-331-3p与WT-SNHG7共转染的TPC-1细胞的荧光素酶活性显著降低（

P

＜0.05）；而miR-331-3p与MUTSNHG7共转染的TPC-1细胞的荧光素酶活性差异不 显著，见 表4。pcDNA-SNHG7组细 胞TPC-1中miR-331-3p的表达水平显著低于pcDNA组［（0.33±0.03）比（1.00±0.07），

P

＜0.05］；si-SNHG7组 细 胞TPC-1中miR-331-3p的表达水平显著高于si-NC组［（2.37±0.20）比（1.01±0.11），

P

＜0.05］。提示SNHG7可靶向调控miR-331-3p的表达。

表4 TPC-1细胞的荧光素酶活性/±s

2.5 抑制miR-331-3p表达逆转干扰SNHG7表达对甲状腺癌TPC-1细胞增殖的抑制作用

与si-NC组相比，si-SNHG7组Cyclin D1表达水平和TPC-1细胞活性降低，而p21表达水平升高；TPC-1细胞活性显著降低（

P

＜0.05）；与si-SNHG7+anti-miR-NC组相比，si-SNHG7+anti-miR-331-3p组Cyclin D1表达 水平和TPC-1细胞活升高，而p21表达水平降低（

P

＜0.05）。提示抑制miR-331-3p表达逆转干扰SNHG7表达对甲状腺癌TPC-1细胞增殖的抑制作用。见图2，表5。

表5 抑制miR-331-3p表达逆转干扰SNHG7表达对甲状腺癌TPC-1细胞增殖的抑制作用/xˉ±s

图2 Western blotting法检测各组细胞增殖相关蛋白表达

2.6 抑制miR-331-3p和SNHG7表达对TPC-1细胞迁移侵袭的作用

与si-NC组相比，si-SNHG7组E-caherin表达水平升高，N-cadherin表达水平和TPC-1细胞迁移侵袭数降低（

P

＜0.05）；与si-SNHG7+anti-miRNC组相比，si-SNHG7+anti-miR-331-3p组E-caherin表达水平降低，而N-cadherin表达水平和TPC-1细胞迁移和侵袭数升高（

P

＜0.05），见图3，表6。

表6 抑制miR-331-3p和SNHG7表达对TPC-1细胞迁移侵袭的作用/xˉ±s

图3 Western blotting法检测各组细胞迁移及侵袭相关蛋白表达

3 讨论

研究发现SNHG7在胰腺癌组织和细胞系中均高表达水平，SNHG7敲低抑制胰腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭。SNHG7在胃癌组织和细胞中也上调表达，SNHG7表达受到干扰后，细胞凋亡率增加、G1/G0期细胞周期停滞，胃癌细胞的增殖受到抑制。SNHG7敲低通过miR-503抑制细胞周期蛋白D1表达，诱导细胞周期停滞在G0/G1期并抑制前列腺癌生长，揭示通过lncRNA/miRNA/mRNA轴可以影响肿瘤的生长。本研究中，甲状腺癌细胞中SNHG7也同样高表达，SNHG7靶向调控miR-331-3p，干扰SNHG7上调miR-331-3p，抑制CyclinD1蛋白的表达，抑制甲状腺癌TPC-1细胞增殖。提示SNHG7可能通过miR-331-3p/CyclinD1影响甲状腺癌TPC-1细胞的增殖。此外，干扰SNHG7还促进p21的表达，而p21是一种新的抑癌基因，故干扰SNHG7通过促进p21的表达抑制癌细胞的产生。

研究发现miR-331-3p可抑制多种癌细胞增殖。本研究结果发现，人甲状腺癌细胞系中miR-331-3p下调表达，说明miR-331-3p在甲状腺癌中也可能有抑癌作用。

上皮-间质转化（EMT）是指有极性的上皮细胞在特定的生理和病理情况下转化成间质细胞的现象，与肿瘤细胞的侵袭转移相关。E-钙黏蛋白（Ecadherin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）均是EMT的生物标志物，也转移、侵袭相关。研究发现E-cadherin水平与甲状腺癌的去分化程度、浸润及转移密切相关，下调E-cadherin的表达会促进甲状腺癌转移。甲状腺乳头状癌中的N-cadherin显著上调，促进了癌细胞的生长和侵袭。本研究结果显示，干扰SNHG7表达可抑制N-cadherin表达，促进E-caherin表达，且抑制TPC-1细胞的迁移和侵袭，提示SNHG7可能通过调控N-cadherin和E-caherin的表达影响甲状腺癌细胞迁移和侵袭。而miR-331-3p抑制表达逆转了干扰SNHG7表达对TPC-1细胞中CyclinD1、N-cadherin、p21、E-caherin蛋白的表达，逆转了干扰SNHG7表达对TPC-1细胞增殖、迁移和侵袭的作用；说明SNHG7可能通过调控miR-331-3p影响CyclinD1、N-cadherin、p21、E-caherin蛋白的表达进而影响TPC-1细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，干扰lncRNA SNHG7表达可通过上调miR-331-3p抑制甲状腺癌TPC-1细胞的增殖、迁移和侵袭。