慢病毒介导的细胞分裂周期相关蛋白2基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

矫璐宇，秦春新，杨小青，于浩，王子良

乳腺癌是女性疾病中常见恶性肿瘤之一，随着 现代生活节奏的加快及生活压力的增大导致乳腺癌呈年轻化发展趋势。研究表明乳腺癌发病机制与细胞周期异常、细胞恶性增殖等密切相关。细胞分裂周期相关蛋白2（CDCA2）可调控细胞周期进程，研究报道指出CDCA2在胰腺导管腺癌组织中表达水平明显升高，敲低CDCA2表达可抑制胰腺癌细胞增殖能力。CDCA2在肺腺癌组织中高表达，其表达量升高可作为肺腺癌患者预后不良的独立预测因子，进一步研究发现抑制CDCA2表达可通过下调细胞周期蛋白E1（CCNE1）而抑制肺腺癌细胞的增殖，而过表达CDCA2通过上调CCNE1促进肺腺癌细胞增殖。但CDCA2在乳腺癌致病机制中的研究尚未见相关报道。慢病毒siRNA干扰具有持续时间长、稳定性高等优点的敲除工具。本研究自2019年2—7月通过慢病毒介导的RNAi技术沉默乳腺癌细胞中CDCA2基因表达，观察其对细胞增殖、凋亡及克隆能力的影响，探讨其在乳腺癌治疗及预防乳腺癌的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A购自上海昱都生物科技有限公司；乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549购自上海慧颖生物科技有限公司；高度免疫缺陷雄性小鼠（20只），体质量范围为20～30 g，购自北京维通达生物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2017-0008。本研究中对于大鼠的处理符合动物伦理学相关标准。慢病毒LV3-shCDCA2、LV3-shNC均购自上海吉玛制药技术有限公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；细胞凋亡试剂盒购自美国Beckman公司；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒均购自日本TaKaRa公司；鼠抗人细胞周期素D1（Cyclin D1）、CDK4、P21、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X（Bax）多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；兔抗人CDCA2单抗购自上海玉博生物科技有限公司（NeoMarkers品牌代理）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；MTT购自上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及慢病毒感染乳腺癌MCF-7细胞人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A、乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、BT549细胞置于含有10%胎牛血清及1%青链霉素的RPMI 1640培养基内，放入37℃、5%二氧化碳体积分数、相对湿度95%的培养箱内培养，细胞以1∶2比例进行传代，待细胞稳定传代2～3代后，收集对数生长期乳腺癌MCF-7细胞，慢病毒LV3-shNC是不含目的基因的真核表达载体，慢病毒LV3-shCDCA2是含有CDCA2特异性siRNA表达载体。采用病毒介导法分别将LV3-shNC、LV3-shCDCA2转染乳腺癌MCF-7细胞，应用已确定筛选浓度的嘌呤霉素培养液进行抗性筛选，每隔2 d更换一次培养液，实时观察细胞生长状况，培养14 d后选取抗性克隆团进行后续实验，进一步扩大培养后，抗性克隆形成7 d后，收集抗性克隆细胞，实验将其分为对照组（空白组）、Lv-NC组（阴性对照组）、Lv-siRNA-CDCA2组（干扰组）。

1.2.2 qRT-PCR检测细胞中CDCA2 mRNA表达水平采用Trizol法提取各组细胞总RNA，应用反转录试剂盒合成cDNA，反应条件为42℃30 min，95℃变性5 min，4℃退火5 min，cDNA进行qRT-PCR，反应条件为95℃预变性5 min循环1次，95℃变性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循环40次，实验结果采用2法进行计算，即2，每组均设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.3 噻唑蓝（MTT）检测细胞增殖分别收集各组乳腺癌MCF-7细胞，以每孔5×10个细胞的密度将细胞接种于96孔板，放入37℃恒温培养箱继续培养，分别于24 h、48 h、72 h时每孔分别加入20 μL质量分数为5 mg/mL的MTT，放入37℃恒温培养箱继续培养4 h，弃上清液，每孔各加入150 μL DMSO，充分溶解后，振荡10 min，选择490 nm波长在酶标仪上检测各孔光密度值（OD）。

1.2.4 平板克隆形成实验收集对数生长期各组乳腺癌MCF-7细胞，使用0.25%胰酶消化细胞制备单细胞悬液，采用台酚蓝计数细胞，按照每孔300个细胞的密度将细胞接种于6孔板，每组细胞均设置3个复孔，按照“十”字方向晃动培养板促使细胞均匀分散，放入37℃恒温培养箱继续培养14 d，每天需将培养板置于显微镜下观察细胞克隆形成情况，若培养板上出现肉眼可见克隆需终止培养，弃培养液，使用预冷PBS洗涤2次，加入甲醇3 mL固定15 min，弃固定液，加入吉姆萨染液2 mL染色30 min，冲洗染色液，干燥，置于显微镜下观察克隆大小，将超过50个细胞团进行计数，克隆形成率（%）=（平均克隆数/每孔接种细胞数）×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡分别收集各组乳腺癌MCF-7细胞，以每孔5×10个细胞的密度将细胞接种于6孔板，放入37℃恒温培养箱继续培养72 h，参照Annexin V-FITC/PI上染细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测CDCA2、Cyclin D1、CDK4、P21、Bcl-2、Bax蛋白表达采用预冷RIPA裂解液处理各组细胞，应用超声破碎仪破碎细胞，4℃，12 000 r/min转速10 min（离心半径6cm），提取细胞总蛋白，采用BCA法定量蛋白，取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳反应，转膜，室温条件下采用5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入稀释后的一抗（稀释比1∶1 000）4℃过夜，TBST清洗，室温条件下加入稀释后的二抗（稀释比1∶5 000），ECL显影，置于自动凝胶成像系统分析各蛋白条带，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。

1.2.7 裸鼠移植瘤实验LV3-shNC、LV3-shCDCA2转染乳腺癌MCF-7细胞，转染24 h后弃旧培养基，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液（1×10个/100 μL），4℃条件下，转速1 000 r/min离心5 min，预冷PBS洗涤，1 mL注射器吸取100 μL细胞悬液注射入小鼠右侧腋窝皮下，观察并记录裸鼠生长及移植瘤成长状况，每周分别检测肿瘤体积，第5周时使用脱颈法处死裸鼠，剥离肿瘤组织并进行称重。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞中CDCA2表达水平

qRT-PCR与Western blotting实验结果显示，与MCF-10A相比，乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549中CDCA2 mRNA及蛋白表达水平均显著升高（

P

＜0.05），其中乳腺癌MCF-7细胞中CDCA2的表达水平升高最为显著，因此选取乳腺癌MCF-7细胞进行后续研究，见图1，表1。

图1 乳腺癌细胞中CDCA2蛋白表达条带

表1 乳腺癌细胞中CDCA2表达/±s

2.2 重组慢病毒siRNA CDCA2感染MCF-7细胞后CDCA2表达水平

qRT-PCR与Western blotting法验证重组慢病毒介导CDCA2基因沉默效果，结果显示，与Lv-NC组相比，Lv-siRNA-CDCA2组乳腺癌MCF-7细胞中CDCA2 mRNA及蛋白表达水平均显著降低（

P

＜0.05），而对照组与Lv-NC组相比差异无统计学意义（

P＞

0.05），见图2，表2。

图2 各组MCF-7细胞中CDCA2蛋白表达条带

表2 MCF-7细胞中CDCA2表达/±s

2.3 沉默CDCA2对MCF-7细胞增殖的影响

MTT实验检测沉默CDCA2对MCF-7细胞增殖的影响，结果显示，相对于Lv-NC组，Lv-siRNA-CDCA2组乳腺癌MCF-7细胞增殖活性显著降低（

P

＜0.05），Western blotting实验 结 果显示Lv-siRNA-CDCA2组乳腺癌MCF-7细胞中Cyclin D1、CDK4蛋白水平显著低于Lv-NC组（

P

＜0.05），而P21蛋白水平显著升高（

P

＜0.05），见图3，表3。

表3 沉默CDCA2对MCF-7细胞增殖的影响/±s

图3 各组乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖相关蛋白表达条带

2.4 沉默CDCA2对MCF-7细胞克隆形成能力的影响

克隆形成实验结果对照组、Lv-NC组、Lv-siRNA-CDCA2组克隆形成率分别为（46.31±5.98）%、（43.27±5.81）%、（12.34±1.25）%，相对于Lv-NC组，Lv-siRNA-CDCA2组乳腺癌MCF-7细胞克隆形成率显著降低（

F

=134.209，

P

＜0.05）。

2.5 CDCA2基因对裸鼠移植瘤生长的影响

裸鼠移植瘤实验结果显示，与Lv-NC组比较，Lv-siRNA-CDCA2组移植瘤体积和体质量均显著降低（

P

＜0.05）；对照组体积、体质量比较差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见图4。

图4 各组裸鼠肿瘤生长

2.6 沉默CDCA2对MCF-7细胞凋亡的影响

流式细胞术检测沉默CDCA2对MCF-7细胞凋亡的影响，结果显示，Lv-siRNA-CDCA2组细胞凋亡率显著升高（

P

＜0.05），Western blotting实验结果显示，LvsiRNA-CDCA2组乳腺癌MCF-7细胞Bcl-2蛋白水平显著降低（

P

＜0.05），而Bax蛋白水平显著升高（

P

＜0.05），见图5，表4。

图5 沉默CDCA2对MCF-7细胞凋亡的影响：A为各组MCF-7细胞流式凋亡图；B为各组MCF-7细胞凋亡相关蛋白表达条带

表4 沉默CDCA2对MCF-7细胞凋亡的影响/±s

3 讨论

乳腺癌细胞增殖与凋亡失衡及细胞迁移、侵袭能力增强可促进该疾病发生及发展，但关于其具体作用机制尚未完全阐明。因而深入探究基因通过哪种途径促进乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭有助于揭示乳腺癌致病机制。研究表明抑制Jab1表达可抑制乳腺癌细胞增殖及迁移。慢病毒介导的SGK3基因沉默可影响乳腺癌细胞增殖及凋亡等生物学过程。相关研究报道指出慢病毒介导MRPS23基因沉默可促进乳腺癌细胞凋亡。因此，本研究积极探寻新型基因与乳腺癌细胞增殖及凋亡等生物学行为的关系，为揭示乳腺癌致病机制提供新方向。

CDCA2基因可通过调控蛋白磷酸酶1γ依赖的DNA损伤进而调控细胞周期进程，研究表明CDCA2基因在多种恶性肿瘤中均呈高表达，其高表达量与患者临床病理分期及其相关临床病理特征密切相关，沉默CDCA2基因表达可诱导细胞周期阻滞，并可抑制肿瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。研究表明CDCA2基因在卵巢上皮癌中的表达水平明显增高，其可通过促进细胞增殖及抑制细胞凋亡发挥促癌基因功能。本研究结果表明CDCA2基因在乳腺癌细胞中的表达水平明显升高，通过慢病毒介导沉默CDCA2基因表达后，乳腺癌细胞中CDCA2基因表达水平显著降低，进一步研究显示沉默CDCA2基因表达后乳腺癌细胞增殖能力明显降低，Cyclin D1、CDK4蛋白水平明显降低，而P21蛋白水平明显升高，已有研究报道指出Cyclin D1与CDK4形成Cyclin-CDK复合物进而正向调控细胞周期进程，促进细胞增殖，P21在多种恶性肿瘤中均呈低表达，并可抑制细胞周期依赖性激酶活性而抑制Cyclin-CDK复合物形成进而抑制肿瘤细胞增殖，且具有抑癌作用。提示沉默CDCA2基因表达可通过促进P21表达及抑制Cyclin D1、CDK4表达进而抑制乳腺癌细胞增殖。Bcl-2属于原癌基因并可抑制细胞凋亡，Bax是促凋亡基因并可促进细胞凋亡。本研究结果表明沉默CDCA2基因表达可促进乳腺癌细胞凋亡，Bax表达上调，而Bcl-2表达下调，说明沉默CDCA2基因可通过激活细胞凋亡基因Bax表达而抑制原癌基因Bcl-2表达。提示沉默CDCA2基因诱导乳腺癌细胞凋亡可能是通过调控细胞凋亡基因表达而发挥作用。同时本研究通过裸鼠移植瘤实验发现沉默CDCA2基因可降低移植瘤体质量及减轻移植瘤体积，提示沉默CDCA2基因可抑制乳腺癌生长。

综上所述，慢病毒介导的RNAi沉默CDCA2基因感染乳腺癌细胞可有效下调CDCA2基因表达，并可通过调控细胞周期及细胞凋亡相关蛋白表达进而抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，可为乳腺癌的基因治疗提供理论依据，为揭示乳腺癌致病机制奠定理论基础。