肠道病毒71型感染的星形胶质细胞中EV71 3C活性与NF-κB信号转导效率的关联

魏容，肖光军，刘艳婷，杨娜

肠道病毒71型（Enterovirus Type 71，EV71）是已知的可引发婴幼儿发生手足口病的主要病原体，是人类A型肠道病毒中属于核糖核酸病毒科中的肠道病毒属。其基因组主要为单股正链的RNA，其长度可达到7 400个核苷酸，EV71最早发现于患有中枢神经系统障碍的加利福尼亚婴儿的粪便中。报道指出，EV71的分布区域主要是星形胶质细胞的细胞核和细胞浆内，大部分分布于细胞浆，少部分在细胞核；脊髓前角炎症的炎症细胞和神经元、脑干等部位也有分布，推测EV71可通过外周神经对中枢神经产生逆向感染。EV71 3C是一种半胱氨酸蛋白酶，由谷氨酸（glu）、半胱氨酸（cys147）和组氨酸（his40）构成酶活性中心，其活性中心与病毒的发展有关联。3C蛋白参与了病毒复制的几乎所有过程，其具有稳定、特殊的β-折叠的空间结构，可作用于丝氨酸/半胱氨酸（Ser/Cys）。白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）已知的两种重要因子，其表达的下调可促进病原体的入侵。IL-6主要在急性反应、造血调控、免疫应答等方面具有显著功效，当其异常表达时可引发多种临床疾病；IL-8主要是能够趋化炎症细胞，促进一系活性物质的释放，导致炎症反应的发生，达到促使异常细胞凋亡和杀菌的作用。目前，对于肠道病毒71型感染的研究报道很多，但对肠道病毒71型感染的星形胶质细胞中EV71 3C活性与细胞内相关信号的传导关系尚不明确，因此，2018年3月至2019年3月进行本研究，旨在探究肠道病毒71型感染的星形胶质细胞中EV71 3C活性与核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号转导效率的关联。

1 资料与方法

1.1 一般资料

EV71病毒于2012年从安徽阜阳病毒感染治疗实验室中一名重症EV71感染的男童呼吸道的血性分泌物中分离得到，属于C4亚型，其基因序列EU812515.1。星形胶质细胞从本实验室分离获取（注：该毒株已经经过检验确立为标准毒株）。

1.2 方法

像《摩西五经》所规定的这种仪式的制度太严格了，他要求食品完全一致。其实摩西是把以色列的饮食神圣化、规格化了，使其完全同一。而中国的春节或其他节日，只有一样相同，其他可以不同，如春节包饺子，元宵节吃元宵，端午节吃粽子，中秋节吃月饼，但是其他的菜肴则根据各地区、各家的喜好，自行安排。

1.2.1 星形胶质细胞的原代培养取实验室新出生的SD乳鼠1～3 d，使用75%乙醇进行消毒浸泡5 min左右。眼科剪取出大脑皮质放置于含Hanks培养皿内，剥离血管组织和脑膜，将大脑皮质快速转移至含DMEM培养液的无菌培养皿中剪碎并过滤，使用无菌玻璃器皿将脑组织进一步碾碎，转移至无菌培养瓶中，加入DMEM培养液后反复吹打使其形成单细胞悬液，加入小牛血清保证终浓度为20%，细胞浓度为2×10个/毫升，置于培养箱中进行差速粘附处理，而后旋转培养瓶，将细胞悬液接种于含鼠尾胶原包被的培养瓶内，置于培养箱中继续培养，并在倒置显微镜下观察其生长状态。

像王伯琦和蔡枢衡这些民国学者清晰地认识到，社会本位对于中国而言，有其存在的价值和意义。但是，再好的东西也必须考虑到我们自己的实际情况。从内心而言，他们也都认可社会本位所追求的公共利益。然而，他们之所以提出不同的观点，原因在于：第一，中国没有个人权利观念作为发展社会本位的根基，所以，抛开个人本位，直接采社会本位法律实际上是在大跃进，或者说是急功近利。第二，因为中国封建传统文化的影响，所以要采用社会本位作为中国法律本位，这种说法没有说服国人的理论依据和可行性依据。而且，民国的一些学者之所以采社会本位，实则是在要求国人履行义务本位，放弃个人权利的实现。

1.2.2 星形胶质细胞的传代培养当细胞铺满培养瓶底部，将原培养基弃除，使用胰酶消化1 min左右，迅速吸除胰酶，加入已配制的完全培养基，制成细胞悬液，按照要求将其分别加入到新的无菌培养瓶内，继续培养。

方案提出，严禁幼儿园教授小学课程内容。幼儿园不得布置幼儿完成小学内容家庭作业、组织小学内容有关考试测验；不得以举办兴趣班、特长班、实验班等为名进行各种提前学习和强化训练活动；不得进行有损幼儿身心健康的比赛、表演或训练；不得擅自组织幼儿参加民间组织的竞赛、评奖或者其他社会活动。社会培训机构不得以学前班、幼小衔接等名义提前教授小学内容。纠正幼儿园以机械背诵、记忆、抄写、计算等方式进行知识技能性强化训练等“小学化”教育方式，并整治“小学化”教育环境。

1.2.3 质粒提取和转染质粒由深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司构建，利用氯化钙法进行感受态细胞制备，通过转化和定点突变后，随即进行基因转染，其中质粒量和转染试剂的比值按照1∶2.5进行。

1.2.4 病毒TCID50的测定将星形胶质细胞按照2×10个/孔，待其培养一天后接种病毒，加入10 mL稀释液，滴加入96孔板中，每孔100 μL，当其共同生长2 h后吸除病毒液，转用培养基进行培养。观察1周左右，根据公式T=10进行病毒滴度计算。

2.3 EV71感染对星形胶质细胞内细胞因子mRNA表达的作用

EV71感染后，细胞内IL-6、IL-8、IL-12及IL-1β的表达均在12 h后显著提高。见表2，3。

1.2.6 RNA提取和反转录PCR根据细胞内RNA提取试剂盒说明书操作步骤进行细胞内RNA提取，并采用脱氧核糖核酸酶（DNase）处理以去除DNA残留。按照Invitrogen反转录试剂盒进行反转录，得到最终产物cDNA。反转录反应体系：Prime ScriptTM RT Enzyme Mix 1 μL；5×Prime ScriptTM Buffer 4 μL；Total RNA 1 μL；Oligo 50UM 1 μL；DdH2O 13 μL；Total 20 μL。将反转录产物cDNA作为底物模板，进行PCR反应，并按照95℃3 min，95℃10 s，55℃5 s，68℃5 s，65～95℃5 s递增的程序进行产物扩增。PCR体系：PCR Reverse Primer 1 μL；PCR Forward Primer 1 μL；SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL；CDNA 1.5 μL；DdH2O 9 μL；Total 25 μL。

1.2.7 免疫共沉淀收集细胞，加入裂解液冰浴裂解30 min，20 000 r/min离心15 min。取上清液，按5∶1比例进行加入上清液和上样缓冲液，加热变性。剩余上清中加入琼脂糖珠（含偶联抗体），4℃震荡12 h。洗涤琼脂糖珠后加入RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer），将其平分到样品中，用PBS洗涤4次，加入上样缓冲液，随即进行热变性。

监测计划设计是明确监测目的，并在调查研究的基础上确定监测项目，布设监测网(点)，合理安排采样频率和采样时间，选择采样方法和分析测定技术，提出监测报告要求，制定质量控制和保证措施及实施计划等。对监测计划设计的审核是审核工作的前提，目的是要把误差消灭在源头，使质量保证工作与监测工作同步进行。

2.2 EV71感染对TAK1相关蛋白的影响

TGF-β活化激酶-1（TAK1）是已知介导NF-kB通路的主要调节蛋白，EV71 3C可用于TAK1蛋白的切割。EV71感染对细胞内TAK1蛋白与其复合体蛋白的表达见图1。

2 结果

2.4 EV71 3C切割导致TAKI复合体缺失对NF-kB的影响

TAB2可诱导NF-kB激活，而与3C共同表达时可显著抑制NF-kB表达。EV71 3C可显著抑制由TAK1复合体作用诱导NF-kB的激活。见表4。

表1 引物序列

1.2.8 Western blotting实验检测蛋白表达将上述处理的样品加入提前配制并凝固的电泳胶内，进行PAGE电泳。当其条带出现离底部1 cm左右，停止电泳，进行蛋白转膜实验。转膜过程中保持低温环境，当蛋白转移完全后，立即进行封闭、抗体孵育，待抗体孵育后，可将其洗涤3次，加入显色液，置于化学发光成像仪下进行成像。

免疫共沉淀具体步骤：①转染后24～48 h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min，细胞裂解液于4℃，最大转速离心30 min后取上清；②取少量裂解液以备Western blotting分析，剩余裂解液加1 μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；③取10 μL protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3 000 r/min离心3 min；④将预处理过的10 μL protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2～4 h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；⑤免疫沉淀反应后，在4℃以3 000 r/min速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1 mL裂解缓冲液洗3～4次；加入2×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min；⑥聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白。

由图1可知，EV71感染可诱导TAK1和其复合体蛋白TAB123的降解，并呈现时间依赖性，24h：TAB1（125.86±39.87），TAB2（352.12±42.36），TAB3（195.20±29.75）。但对于TRAF2和TBK1表达无影响。

图1 EV71感染对星形胶质细胞内TAK1蛋白复合体的影响

1.2.5 EV71 3C活性测定将细胞以3×10个/孔接种于24孔板中，当细胞生长铺满瓶底成片时，即可进行细胞转染基因质粒，分别为NF-κB、激活子蛋白-1（AP-1）和报告基因（pRL-SV40）基因质粒，对照组采用空载体进行代替。转染后收集细胞，加入细胞瘤裂解液，室温下放置30 min，吸取30 μL的裂解液加入96孔板内，进行EV71 3C活性检测。反应体系（100 μL）：荧光底物浓度分别为0、5、25、50、80、100、120 μmol/L，3C蛋白酶浓度为1 μmol/L，混匀后立即进行动力学检测，得到底物浓度与荧光强度的关系。根据每一组反应前10 min对应的荧光值选取计算反应初速度，定义酶反应初速度为单位时间内切割荧光底物产生的荧光强度。以底物浓度的倒数为横坐标，酶反应速率的倒数为纵坐标建立米氏方程的模拟形式。通过作散点图得到仿米氏方程一般式为

y

=2.448 1

x

+0.04，R=0.925。选取荧光底物浓度为20 μmol/L，3C蛋白酶浓度为1 μmol/L进行动力学反应，荧光强度与时间的线性关系为

y

=10.242

x

+5.030 3。

表2 EV71感染对细胞内相关因子mRNA表达的影响/±s

2.1 引物设计结果

利用NCBI软件，遵循引物设计原则进行引物设计，其结果如表1所示。

但是，我这样做就把叶霭玲逼到了一个绝杀的赛点上。她不得不对我发出了决裂的宣言，宣布与我彻底断绝关系。我以为这件事到此也就解决了。可是真要与叶霭玲决裂了，倒使我考虑将来究竟怎么办？难道我真的打算娶白丽筠为妻吗？

表4 TAB2质粒导入或者TAK1复合体质粒导入对NF-kB蛋白表达的影响/±s

2.5 EV71 3C活性与NF-kB mRNA和NF-kB蛋白表达的影响

不同浓度EV71感染后细胞内EV71 3C活性及其细胞内NF-kB表达见表5、图2和图3。当不同浓度的EV71感染细胞后，细胞内EV71 3C活性出现明显差异，而随着蛋白酶活性的增加，细胞内NF-kB mRNA的表达成明显的下调趋势。不同浓度EV71感染后细胞内EV71 3C活性及其细胞内NF-kB蛋白表达见表5。由表5可知，当不同浓度的EV71感染细胞后，细胞内EV71 3C活性出现明显差异，而随着蛋白酶活性的增加，细胞内NF-kB蛋白的表达成明显下降（酶活性1 μmol/L时NF-kB蛋白/βactin为0.23±0.06）。

图2 NF-kB的mRNA表达水平（M：GAPDH分子量146kD）

图3 NF-kB的蛋白表达水平

表5 EV71 3C活性对NF-kB mRNA的表达/±s

表3 EV71感染对细胞内相关因子mRNA表达的影响/±s

3 讨论

EV71是肠道病毒属中一种小RNA病毒科，其RNA主要为单股正旋，具有较强的耐酸和耐热特性，决定了EV71能通过粪、口传播和自我复制的高耐热功能。其致病属于是多分子、多因素、多途径的作用过程，病毒的免疫结果和机体的抗免疫功能决定了病毒的感染结果，然而，儿童的不健全、不成熟的免疫系统极易使其成为感染机体。当病儿感染EV71后症状较轻，但当其成为重症病例时，可导致神经系统和呼吸感染、循环功能障碍。星形胶质细胞是神经胶质细胞的一种，具有独立的结构域，和神经元之间具有明显、广泛的形态学交互作用，其主要功能是摄取和清除突触前由神经元释放的神经递质如γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸等用于再循环。同时，星形胶质细胞通过清理存在的神经递质达到预防由谷氨酸诱导产生的神经毒性，并能通过摄取金属离子来维持神经元内的电化学平衡。报道称，星形胶质细胞在一定条件下可释放信号传导分子如胶质递质。近年来，EV71多次流行，基因也在不断的进化，致使儿童致残、致死的病例不断出现。

SOP批准后，组织相关科室人员培训、考核并全院实施。护理部负责对执行情况进行检查，对存在的问题及时整理。每季度组织1次SOP质量改进会议，总结实际应用中存在的优缺点并及时反馈给SOP小组，由SOP小组对其进行修订。SOP确定后，每年进行1次常规的全面审核与修订，当技术规范有新进展或使用过程中发现有需要修订的内容时，及时修订。

EV71 3C可通过将宿主炎性因子水解或抑制其表达，达到DNA修复功能和宿主细胞内蛋白质的合成系统被关闭，进而降低了天然免疫系统对宿主细胞的攻击。当其活性位点发生改变，会造成病毒包装的失败。细胞因子具有多种特定的生物学作用，如调节和介导炎症反应和免疫应答，参与炎症发生的病理损害等。本研究发现EV71感染可诱导TAK1和其复合体蛋白TAB123的降解，并呈现时间依赖性，但对于TRAF2和TBK1表达无影响。同时，细胞内IL6、IL8、IL12及IL1β的表达均在24h后显著提高；TAB2可诱导NF-kB激活，而与3C蛋白共同表达时可显著抑制NF-kB表达，3C蛋白亦可显著抑制由TAK1复合体作用诱导NF-kB的激活。不同浓度EV71感染后，细胞内EV71 3C活性出现明显差异，而随着蛋白酶活性的增加，细胞内NF-kB mRNA和蛋白的表达均成明显的下调趋势。EV71 3C功能与RNA结合功能在宿主和病毒的相互作用及病毒复制中具有重要影响，3C蛋白的酶活性中心在病毒的生命周期和复制过程中均发挥着重要作用。本研究表明，当3C蛋白酶的活性位点发生突变后，则病毒就不能成功的复制出来，因此可作为众多抗病毒药物的重要筛选途径。EV71 3C能在抑制模式下识别RIG-I受体及其下游MAVS效应分子结合，抑制IFNβ产生。同时，EV71 3C可通过切割TLR3信号通路中的TRIF关键蛋白损坏TLR3介导作用，抑制NF-kB激活和IRF3磷酸化。本研究推测，3C亦可通过作用与NF-kB上游分子TAK1，达到阻碍NF-kB信号通路。

病毒可通过多种途径调节TAK1复合体，达到调控NF-kB通路的目的，最终用于调控细胞因子和转录的产生。其中TAK1是调控NF-kB信号传导过程的关键因子。当TAK1受到异常刺激后，即可发生泛素化和磷酸化，与TAB1/2/3之间形成复合体，用于下游信号通路的调节，激活MF-kB、JNK、ERK和P38信号通路。许多病毒可通过调节TAKI信号通路来调控NF-kB通路。HTLV的Tax蛋白在受到外界刺激时，细胞内的信号通路便会激活，Tax与RelA、TAB2之间形成复合物，促使NF-kB的活化。

综上所述，肠道病毒71型感染的星形胶质细胞中EV71 3C可通过调节TAK1蛋白表达，达到抑制NF-κB信号转导的作用。