微小RNA-494-3p靶向配子生成素结合蛋白2促进结直肠癌细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的实验研究

刘敏，吴运

配子生成素结合蛋白2（GGNBP2）也被称为ZFP403，在乳腺癌（包括三阴性乳腺癌）、胶质瘤组织及卵巢癌组织和细胞中表达下调，过表达GGNBP2可抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭。微小RNA-494-3p（miR-494-3p）在肝细胞癌（HCC）组织表达上调并与HCC病人的预后不良和癌细胞转移有关。miR-494-3p在人脑胶质瘤组织和鼻咽癌中表达上调，抑制miR-494-3p可抑制胶质瘤细胞的侵袭、增殖并促进细胞凋亡，抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。然而miR-494-3p和GGNBP2对结直肠癌发生发展的影响尚未可知。本研究于2019年1月至2019年12月以人结直肠上皮细胞NCM460为对照，首先检测了结直肠癌细胞系T84、LS1034、HCT116中miR-494-3p和GGNBP2表达；然后以LS1034为研究对象，探讨miR-494-3p能否靶向GGNBP2影响结直癌细胞侵袭、迁移及上皮间质转化（EMT），以期为结直肠癌的治疗提供新的分子靶标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

人结直肠癌细胞株T84、LS1034、HCT116和人结肠上皮细胞株NCM460购自美国ATCC；胎牛血清（FBS）、DMEM/F-12培养基和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，牛血清白蛋白（BSA）、四基噻唑基四唑（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）和胰蛋白酶购自美国Sigma-Aldrich公司；Transwell板购自美国Corning公司；miR-494-3p模拟物（mimics）和抑制剂（anit-miR-494-3p）、GGNBP2小干扰RNA（si-GGNBP2）和过表达载体（pcDNA-GGNBP2）、模拟对照序列（miR-con）、抑制剂阴性对照序列（anti-miR-con）、小干扰RNA阴性对照（si-con）、空载体（pcDNA-con）、GGNBP2野生型（WT-GGNBP2）和突变型（MUT-GGNBP2）荧光素酶报告载体购自上海吉玛制药有限公司；GGNBP2、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、磷酸化蛋白酪氨酸激酶2（pJak2）、磷酸化信号转导和转录活化因子3（p-STAT3）及β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自英国Abcam公司；荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司；Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂TRIzol、real-time PCR试剂盒、反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司；二喹啉甲酸蛋白（BCA）定量试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；显微镜、全自动酶标仪、发光仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理细胞培养：将人正常结直肠上皮细胞NCM460、人结直肠癌细胞LS1034和HCT116培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，人结直肠癌T84细胞培养于含5%FBS的DMEM/F-12培养基中，培养液均添加100 U/L青霉素和100 mg/L链霉素，将细胞置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。细胞生长密度值90%时，消化传代。

1.2.2 Real-time PCR检测RNA的表达将对数期各细胞浓度调整为2.5×l0个/毫升，接种于6孔板中（每孔2.5 mL）。培养48 h后，弃培养基，用TRIzol试剂提取细胞中总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板行PCR反应。反应程序为：95℃、1 min；95℃、40 s、57℃、30 s、72℃、45 s，35个循环；72℃、10 min。运用2方法进行数据分析。

1.2.3 细胞转染将对数期LS1034细胞浓度调整为2.5×l0个/mL，接种于6孔板中（每孔2.5mL），培养24h后，弃培养基。利用Lipofectamine 2000试剂盒，将miR-con（miR-con组）、miR-494-3p mimics（miR-494-3p组）、anti-miR-con（anti-miR-con组）、anti-miR-494-3p（anti-miR-494-3p组）、pcDNA-con（pcDNA-con组）、pcDNA-GGNBP2（pcDNA-GGNBP2组）、anti-miR-494-3p与si-con（anti-miR-494-3p+sicon组）、anti-miR-494-3p与si-GGNBP2（anti-miR-494-3p+si-GGNBP2组）共转染至LS1034细胞。转染6 h后，换成完全培养基。再培养24 h，收集细胞进行验证，验证成功后进行后续实验。

1.2.4 MTT实验测定细胞活性将转染后的各组LS1034细胞浓度调整至2.5×10个/毫升，接种于96孔板中（每孔200 μL）。同时设置对照（NC）组，接种未转染的LS1034细胞。培养48 h时，加20 μL（5 mg/mL）MTT，孵育4 h。弃上清液，加150 μL DMSO，室温振荡5 min，酶标仪测定490 nm处吸光度（A）值。细胞存活率=（A-A）/（A-A）×100%。

1.2.5 Transwell实验测定细胞迁移和侵袭迁移实验：将LS1034细胞用无血清RPMI1640培养基稀释为1×105个/毫升，取100 μL加至Transwell小室上室，另取500 μL含10%FBS的培养基加至下室。培养48 h，弃培养基。用甲醛固定细胞，并用结晶紫染色后，于显微镜观察并计数，每个样本计数10个视野，取平均值。

侵袭实验：除预先在Transwell小室上室铺用4℃无血清培养基1∶8比例稀释的Matrigel基质胶外，剩余步骤与迁移实验相同。

1.2.6 双荧光素酶报告系统实验将LS1034细胞以2.5×10个/孔接种于24孔板中，培养24 h，弃培养基。利用Lipofectamine 2000试剂盒，将WT-GGNBP2与miR-con或miR-494-3p mimics、MUT-GGNBP2与miR-con或miR-494-3p共 转 染 至LS1034细胞。转染6 h后，换为完全培养基。再培养24 h，弃培养基，加细胞裂解缓冲液裂解20 min。将裂解液离心（3 500 r/min、5 min），收集上清，加入荧光素酶底物，发光仪检测上清中荧光素酶活性，结果以萤火虫与海参的荧光强度比值表示。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达将细胞浓度调整为2.5×l0个/毫升，接种于6孔板中（每孔2.5 mL），细胞分组同1.2.3。培养48 h，弃培养基，加RIPA裂解液孵育20 min，超声破碎细胞，收集蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取蛋白样本进行SDS-PAGE，转膜，室温封闭2 h，加入稀释的一抗（GGNBP2抗 体1∶800、Cyclin D1抗 体1∶1 000、MMP-2抗体1∶2 000、E-cadherin抗体1∶1 500、Vimentin抗体1∶1 000和β-actin抗体1∶2 000），4℃孵育过夜。洗膜后，加稀释的酶标二抗，室温孵育1 h。加化学发光试剂，避光显影后，曝光拍照。以β-actin为内参照，分析目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 miR-494-3p和GGNBP2在结直肠癌细胞系中的表达

与正常结直肠上皮细胞NCM460相比，结直肠癌细胞系T84、LS1034和HCT116中miR-494-3p表达量显著升高，GGNBP2 mRNA的表达量显著下降，GGNBP2蛋白的表达量显著低于NCM460细胞。由于LS1034细胞中miR-494-3p和GGNBP2表达较NCM460细胞差异最显著，因此，选择LS1034细胞进行后续实验。见表1、图1。

表1 结直肠癌细胞系中miR-494-3p和GGNBP2表达/±s

图1 Western blot检测结直肠癌细胞系中GGNBP2蛋白表达

2.2 抑制miR-

4

94-3p对结直肠癌细胞侵袭、迁移及EMT的影响

与anti-miR-con组相比，anti-miR-494-3p组LS1034细胞中miR-494-3p表达量显著下降，细胞存活率、迁移数和侵袭数均显著下降，细胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表达均下降，E-cadherin蛋白表达升高，Vimentin蛋白表达降低。NC组与anti-miR-con组各检测指标比较均差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表2，3。

表2 抑制miR-494-3p对LS1034细胞活性、迁移和侵袭的影响/±s

2.3 过表达GGNBP2对LS1034细胞侵袭、迁移及EMT的影响

与pcDNA-con组相比，pcDNA-GGNBP2组LS1034细胞中GGNBP2蛋白表达量显著上升，细胞存活率、迁移数和侵袭数均显著下降，细胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表达均下降，E-cadherin蛋白表达升高，Vimentin蛋白表达降低。NC组与anti-miR-con组各检测指标比较均差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表4，5。

表4 过表达GGNBP2对LS1034细胞活性、迁移和侵袭的影响/±s

2.4 miR-4

9

4-3p靶向GGNBP2并抑制GGNBP2蛋白的表达

通过生物信息学预测发现，GGNBP2的3’UTR区含有与miR-494-3p互补的核苷酸序列。双荧光素酶报告系统结果显示，与共转染miR-con与WT-GGNBP2的LS1034的细胞比较，共转染miR-494-3p与WT-GGNBP2的LS1034的细胞荧光素酶活 性 显 著 下 降［（0.37±0.08）比（1.00±0.04），

P

＜0.001］，与 共 转 染miR-con与MUT-GGNBP2的LS1034细胞比较，与共转染miR-494-3pWT-GGNBP2的LS1034细胞荧光素酶活性没有明显变化［（0.91±0.11）比（0.95±0.06），

P

=0.480］。Western blot结果发现，与miR-con组相比，miR-494-3p组的GGNBP2蛋 白 表 达 量 显 著 降 低［（0.34±0.09）比（1.00±0.06），

P

＜0.001］；与anti-miR-con组相比，antimiR-494-3p组的GGNBP2蛋白表达量显著下降［（2.04±0.14）比（0.87±0.12），

P

＜0.001］。

表3 抑制miR-494-3p对LS1034细胞中Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响/±s

2.5 沉默GGNBP2部分逆转抑制miR-494-3p对结直肠癌细胞侵袭迁移及EMT影响

与anti-miR-494-3p+si-con组 相 比，anti-miR-494-3p+si-GGNBP2组GGNBP2蛋白表达量显著降低，细胞存活率、迁移数和侵袭数均显著上升，细胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表达均升高，E-cadherin蛋白表达下降，Vimentin蛋白表达升高。见表6，7。

表5 过表达GGNBP2对LS1034细胞中Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响/±s

表6 沉默GGNBP2逆转抑制miR-494-3p对LS1034细胞活性、迁移和侵袭的影响/±s

3 讨论

结直肠癌的复发转移是导致病人死亡的主要原因。研究表明，miRNA参与调控结直肠癌复发转移，可作为结直肠癌治疗的分子靶点。miR-494在多种癌组织中出现异常表达，有研究结果表明，在大多数癌症中，miR-494的高表达可能预示着较好的总体生存率，而在结直肠癌和非小细胞肺癌中，过表达miR-494可能预示着较差的总体生存率。miR-494在结直肠癌组织和细胞系中表达上调，并通过靶向PTEN基因促进细胞迁移和侵袭。Zhang等也研究发现，miR-494在结直肠癌组织中表达水平显著上调，其通过靶向腺瘤性结肠息肉病基因（APC）诱导Wnt/β-catenin信号通路，促进癌细胞的生长。本研究发现，抑制miR-494-3p表达可以抑制LS1034细胞存活、迁移和侵袭并抑制EMT。这与Zhang等结果一致，证实miR-494-3p促进结直肠癌的发展进程。

表7 沉默GGNBP2部分逆转抑制miR-494-3p对LS1034细胞中Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响/±s

生物信息学预测发现，GGNBP2的3’UTR序列中含有与miR-494-3p互补的序列，提示GGNBP2和miR-494-3p之间可能存在调控关系，GGNBP2可能参与miR-494-3p对结直肠癌的调控过程。GGNBP2（又称ZNF403）是一种肿瘤抑制因子，与多种癌症的增殖、迁移和侵袭有关，支持细胞的形态和功能，在精子发生过程起关键作用。有报道表明，GGNBP2在卵巢癌中的下调促进了卵巢癌的耐药。在人细胞中敲除GGNBP2可影响细胞周期调控基因的表达谱，促进G2/M细胞周期的阻滞，p21蛋白上调，MCM2蛋白下调；在人喉癌细胞Hep-2中敲除GGNBP2具有抗癌作用，抑制癌细胞增殖和迁移。但GGNBP2在结直肠癌中表达和作用尚不清楚。本研究 发 现，GGNBP2结 直 肠 癌 细 胞T84、LS1034和HCT116中表达下调，过表达GGNBP2可抑制LS1034细胞存活、迁移和侵袭并抑制EMT，同样说明过表达GGNBP2具有抑癌作用。双荧光素酶报告系统结果显示，miR-494-3p靶向负调控GGNBP2的表达，沉默GGNBP2表达可部分逆转抑制miR-494-3p对LS1034细胞侵袭迁移和EMT的作用，说明miR-494-3p通过调控GGNBP2促进肿瘤发生和发展。

综上，本研究阐述了在结直肠癌LS1034细胞中miR-494-3p通过靶向下调GGNBP2表达促进结直肠癌LS1034细胞迁移、侵袭和EMT，miR-494-3p/GGNBP2可能为结直肠癌的治疗提供了潜在分子靶点。