miR-103靶向钙调磷酸酶调节蛋白1对糖尿病肾病足细胞损伤的影响

宋现静，刘明，吕文山

糖尿病肾病属于糖尿病慢性并发症，随着疾病发展可引发终末期肾病。既往研究显示免疫与炎症反应失衡与糖尿病肾病病人足细胞损伤密切相关。研究表明微小RNA-103（miR-103）在2型糖尿病大鼠外周血单核细胞中高表达。TargetScan预测显示钙调磷酸酶调节蛋白RCAN 1（regulator of calcineurin 1，RCAN 1），可能是miR-103的靶基因，研究表明敲除RCAN1可加重阿霉素肾病小鼠的蛋白尿及足细胞损伤。本研究从2018年1月至2019年1月期间主要探究miR-103在高糖诱导的足细胞中的表达变化，分析干扰miR-103的表达对高糖诱导的足细胞凋亡及炎性因子分泌的影响，初步探讨miR-103对RCAN1的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人足细胞（human podocytecell，HPC）购自美国ATCC细胞库。Trizol试剂、RT Reagent Kit With gDNA Eraser与SYBR Premix Ex Taq试剂均购自日本TaKaRa公司；兔抗人RCAN1、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体均购自美国Abcam公司；HRP标记的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒购自上海江莱生物股份有限公司；miR-103特异性寡核苷酸抑制剂（anti-miR-103）及其阴性对照（anti-miR-con）、miR-103寡核苷酸模拟物（miR-103 mimics）及 阴 性 对 照mimic NC序 列（miR-con）、RCAN1小分子干扰RNA（si-RCAN1）及其阴性对照（si-con）均购自上海吉玛制药技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组HPC细胞接种于6孔板，待HPC细胞分化成熟进行高糖刺激，25 mmol/L高糖分别刺激6、12、24 h，检测各组足细胞凋亡率，筛选适宜浓度进行后续实验。实验分组：正常糖组（NG组）、高糖（HG）6 h组、HG12 h组、HG 24 h组。干扰miR-103表达对高糖刺激人足细胞凋亡和炎性因子分泌的影响。实验分组：HG+anti-miR-con组（足细胞中转染anti-miR-con 24 h，含有25 mmol/L高糖的培养液培养12 h）、HG+anti-miR-103组（足细胞中转染anti-miR-103 24 h，含有25 mmol/L高糖的培养液培养12 h）。miR-103调控RCAN1的表达，实验分组：miR-con组（HPC细胞中转染miR-con 24h）、miR-103组（HPC细胞中转染miR-103 mimics 24 h）、anti-miR-con组（HPC细胞中转染anti-miR-con 24 h）、anti-miR-103组（HPC细胞中转染anti-miR-103 24 h）。过表达RCAN1对高糖刺激人足细胞凋亡和炎症因子分泌的影响，实验分组：HG+pcDNA组（HPC细胞中转染pcDNA 24 h，含有25 mmol/L高糖 的 培 养 液 培 养12 h）、HG+pcDNA-RCAN1组（HPC细胞中转染pcDNA-RCAN1 24 h，含有25 mmol/L高糖的培养液培养12 h）。干扰RCAN的表达联合干扰miR-103的表达对高糖刺激人足细胞的作用，实验分组：HG+anti-miR-103+si-con组（HPC细胞共转染anti-miR-103与si-con 24 h，含有25 mM高糖的培养液培养12 h）、HG+anti-miR-103+si-RCAN1组（HPC细胞共转染anti-miR-103与si-RCAN1 24 h，含有25 mmol/L高糖的培养液培养12 h）。

1.2.2 qRT-PCR检 测 细 胞 中miR-103、RCAN1 mRNA表达水平取各组HPC细胞，提取RNA。按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA。qRT-PCR反应：以cDNA为模板，反应条件为95℃、2 min，95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共循环40次。采用2法计算miR-103、RCAN1 mRNA相对表达量。

1.2.3 检测细胞中IL-6、TNF-α含量收集各组细胞培养液，按照酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒说明书进行操作、检测IL-6、TNF-α含量。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡收集各组HPC细胞10 000 r/min转速离心5 min（4℃），PBS洗涤，加入1 mL结合缓冲液，相同条件下离心，弃上清，分别加入200 μL结合缓冲液，按照凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.5 荧光素酶报告基因检测野生型载体WTRCAN1与突变型载体MUT-RCAN1，取HPC细胞，将WT-RCAN1、MUT-RCAN1分别与miR-103 mimics、miR-con共转染至HPC细胞，37℃恒温培养箱内继续培养48 h，收集细胞，按照荧光素酶活性检测试剂盒检测各组荧光素酶活性。

1.2.6 Western blotting检测RCAN1、Bax、Bcl-2蛋白表达取各组HPC细胞，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，取变性蛋白进行SDS-PAGE，每孔蛋白上样量30 μg，转膜，室温条件下采用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入蛋白一抗稀释液（1∶500），加入二抗稀释液（1∶1 000），应用凝胶成像系统及Quantity one软件检测条带灰度值。

2 结果

2.1 不同浓度高糖刺激对人足细胞miR-103和RCAN1表达的影响

用不同浓度的高糖刺激足细胞，结果显示，与NG组相比，HG 6 h组、HG 12 h组、HG 24 h组足细胞中miR-103的表达水平升高（

P

＜0.05），RCAN1 mRNA及蛋白的表达水平降低（

P

＜0.05），见图1、表1。

图1 检测人足细胞中钙调磷酸酶调节蛋白（RCAN）表达

表1 不同浓度高糖诱导人足细胞miR-103和RCAN1的表达/±s

2.2 不同高糖刺激时间对人足细胞凋亡和炎症因子分泌的影响

与NG组相比，HG 6h组、HG12 h组、HG 24 h组足细胞凋亡率、Bax蛋白表达量、IL-6、TNF-α水平升高（

P

＜0.05），Bcl-2蛋白表达量降低（

P

＜0.05），其中HG12 h作用效果较好，用于后续研究，见图2、表2。

表2 不同高糖刺激时间对人足细胞凋亡和炎性因子分泌的影响/±s

图2 检测人足细胞凋亡率（A）和凋亡相关蛋白表达（B）

2.3 干扰miR-103表达抑制高糖刺激人足细胞凋亡和炎性因子分泌

实验结果显示，与HG+antimiR-con组相比，HG+anti-miR-103组高糖刺激的足细胞中miR-103的表达水平、细胞凋亡率、Bax蛋白表达量、IL-6、TNF-α水平降低（

P

＜0.05），Bcl-2蛋白表达量升高（

P

＜0.05），见图3、表3。

表3 干扰miR-103表达抑制高糖刺激人足细胞凋亡和炎症因子分泌/±s

图3 检测人足细胞凋亡相关蛋白表达

2.4 miR-103抑 制RCAN1

miR-103与RCAN1互补的核苷酸序列，见图4A。转染克隆有RCAN1-3’UTR载体质粒实验中，miR-103组荧光素酶活性明显受到抑制，与miR-con组比较，荧光素酶活性差异有 统 计 学意 义［（1.00±0.08）比（0.43±0.05）］（

t

=18.126，

P

＜0.05）；转染MUT-RCAN1实验中，miR-con组与miR-103组荧光素酶活性差异无统计学意义［（0.98±0.11）比（1.16±0.13）］（

t

=3.171，

P

=0.006）。miR-103可 负 向 调 控RCAN1的 表 达。miR-con组、miR-103组、anti-miR-con组、anti-miR-103组RCAN1蛋白水平分别为（0.46±0.06）、（0.21±0.04）、（0.45±0.05）、（0.73±0.07），差异有统计学意义（

F

=129.024，

P

＜0.05），见图4B。

图4 miR-103与钙调磷酸酶调节蛋白1（RCAN1）互补的核苷酸序列（A）以及miR-103调控RCAN1表达（B）

2.5 过表达RCAN1抑制高糖刺激人足细胞凋亡和炎性因子分泌

实验结果显示，相较于HG+pcDNA组，HG+pcDNA-RCAN1组足细胞中RCAN1、Bcl-2蛋白表达量升高（

P

＜0.05），细胞凋亡率、Bax蛋白表达量、IL-6、TNF-α水平降低（

P

＜0.05），见图5、表4。

表4 过表达RCAN1对人足细胞增殖和凋亡的影响/±s

图5 检测人足细胞中钙调磷酸酶调节蛋白1（RCAN1）表达和凋亡相关蛋白表达

2.6 干扰RCAN1表达部分逆转干扰miR-103表达对高糖刺激人足细胞的保护作用

实验结果显示，与HG+anti-miR-103+si-con组比较，HG+anti-miR-103+si-RCAN1组足细胞中RCAN1、Bcl-2蛋白表达量降低（

P

＜0.05），细胞凋亡率、Bax蛋白表达量、IL-6、TNF-α水平升高（

P

＜0.05），见表5、图6。

图6 检测人足细胞中钙调磷酸酶调节蛋白1（RCAN1）表达

表5 干扰RCAN1表达部分逆转干扰miR-103表达对人足细胞增殖和凋亡的作用/±s

3 讨论

糖尿病肾病的主要病理特征为肾小球硬化与足细胞损伤，临床症状主要为尿素氮排泄障碍与尿蛋白排泄增多。研究表明肾小球滤过屏障的主要组成部分是足细胞，而足细胞损伤与肾小球疾病密切相关。因而探究糖尿病肾病足细胞损伤机制对防治糖尿病肾病具有重要意义。

miR-103在缺氧诱导的肺动脉高压鼠的肺组织中表达升高，并可参与肺动脉平滑肌细胞的增殖从而促使血管重塑。研究表明miR-103可参与心肌细胞坏死过程，抑制miR-103的表达可抑制心肌细胞坏死。相关报道指出抑制miR-103的表达可提高2型糖尿病小鼠体内葡萄糖稳态及胰岛素敏感性。本研究结果显示足细胞中miR-103的表达水平显著升高，足细胞凋亡能力增强，Bax表达上调而Bcl-2表达下调。Bax可促进细胞凋亡，而Bcl-2可抑制细胞凋亡。本研究结果显示干扰miR-103的表达可通过上调Bcl-2的表达及下调Bax的表达从而抑制高糖诱导的足细胞凋亡。研究表明足细胞的凋亡、炎症及足突异常改变等均可降低肾功能，炎性因子IL-6、TNF-α水平增加导致足细胞出现炎性反应。本研究结果显示高糖刺激条件下足细胞中IL-6、TNF-α含量显著升高，表明高糖刺激下足细胞固有免疫被激活从而产生炎性反应。本研究发现干扰miR-103的表达可降低IL-6、TNF-α水平，提示干扰miR-103的表达可减轻高糖刺激下足细胞的炎性反应。

RCAN1表达异常与胰岛素抵抗、β细胞线粒体功能障碍及胰岛素分泌功能密切相关。研究表明RCAN1表达量降低与2型糖尿病中线粒体功能异常有关。本研究发现在高糖刺激的足细胞中RCAN1表达量显著降低，提示RCAN1的表达变化可能与足细胞损伤有关。本研究采用过表达载体上调RCAN1的表达，通过观察足细胞凋亡及炎性因子分泌情况推断RCAN1在足细胞损伤过程中的作用，结果显示RCAN1过表达可抑制高糖诱导的足细胞凋亡，能够显著降低IL-6、TNF-α水平，提示RCAN1过表达对足细胞具有保护作用。本研究证实RCAN1是miR-103的靶基因，干扰miR-103的表达可通过上调RCAN1的表达而保护糖尿病肾病足细胞。

综上所述，糖尿病肾病足细胞中miR-103表达升高，而RCAN1表达下调，干扰miR-103的表达可通过上调RCAN1的表达而保护足细胞，并可抑制足细胞凋亡及减轻炎症反应从而避免足细胞损伤，为临床治疗糖尿病肾病提供新方向。但关于miR-103与RCAN1是否在内皮细胞与系膜细胞中表达仍未可知，仍需进一步验证miR-103对糖尿病肾病病人肾脏损伤的影响。