聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析复方川贝散中川贝母成分

张国林，魏星，邢以文，薛满

贝母为百合科植物干燥鳞茎，具有清热润肺、止咳化痰的药理活性。贝母常见品种有川贝母（Fritillariae cirrhosae bulbus）、浙 贝 母（Fritillariae thunbergii bulbus）、平贝母（Fritillarae ussuriensis bulbus）和伊贝母（Fritillariae pallidiflorae bulbus）等。贝母属川贝母止咳化痰效果优于其他贝母，但由于川贝母资源短缺、价格较高，市场上存在掺假掺伪的现象。同时，川贝母多以药材原粉入药，给采用常规方法鉴别带来较大困扰。川贝母ITS区的第75位碱基为C，含有CCCGGG序列的SmaI酶切位点，而非川贝类此位点为T，是CTCGGG序列，无

SmaI

酶切位点。基于此，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）可以实现从分子水平上对川贝母的鉴别。虽然目前有关于分子生物学方法鉴定川贝母的报道，但关于中药制剂中采用分子生物学方法鉴定川贝母的报道较少。本研究研究起止时间为2019年2月至2019年5月，采用PCR-RFLP法对复方川贝散中的川贝母成分进行分析，并以含有平贝母成分的蛇胆川贝液为对照。

1 材料与方法

1.1 药品

国家药品标准物质川贝母（暗紫贝母）（中国食品药品检定研究院，批次121000～201609）；复方川贝散（处方为川贝母、浙贝母和珍珠）（苏州大学附属儿童医院，批号Z04001116，批次20190307）；蛇胆川贝液（广东一力罗定制药有限公司，批号Z44023603，批次180201）；川贝母（无锡葆寿堂药业有限公司，批次Y181204）；珍珠层粉（苏州工业园区天龙制药有限公司，批号Z32020625，批次CF190206）。

1.2 试剂与仪器

新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱）购自上海捷瑞生物工程有限公司（批号0020170104）；Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）购自美国赛默飞世尔科技有限公司（批号00517449）；20μmol引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（上游引物批号2409103320，下游引物批号2409103319）；Nuclease-free Water购自美国赛默飞世尔科技有限公司（批号00513931）；50×TAE缓冲液购自美国Solarbio公司（批号20170620）；AGEAROSE G-10琼脂糖购自西班牙BIOWEST公司（批号111860）；GelRed购自美国Biotium公司（批号14G0805）；10×T Buffer（BSA free）购自日本TaKaRa公司（批号A1801A）；0.1%牛血清白蛋白购自日本TaKaRa公司（批号A4201A）；SmaⅠ购自日本TaKaRa公司（批号AGX0152A）；TissueLyserⅡ组织破碎仪购自德国QIAGEN公司；MK-10干式恒温器购自杭州奥盛仪器有限公司；Lab Dancer漩涡混合器购自德国IKA公司；Transferpette® S移液枪购自德国BRAND公司；Biofuge Primo R高速冷冻离心机购自美国赛默飞世尔科技有限公司；Veriti96热循环仪购自美国应用生物系统公司；PowerBac Basic电泳仪基础电源购自美国伯乐公司；Gel Doc XR+凝胶成像系统购自美国伯乐公司；PURA10通用水浴槽购自优莱博技术（北京）有限公司。

1.3 DNA提取

DNA提取根据新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱）说明书操作。提取完成后用50 μL洗脱缓冲液EB洗脱提取物，将收集的DNA于-20℃保存待用。国家药品标准物质（暗紫贝母）取样量约50 mg，复方川贝散取样量约50 mg，蛇胆川贝液取样量为50 μL。

1.4 PCR扩增

PCR扩增体系为50 μL：Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）25 μL；20 μmol正向引物1 μL；20 μmol反向引物1 μL；无菌超纯水21 μL；DNA模板2 μL。以无菌超纯水代替DNA模板作为空白对照。PCR程序为：95℃、4 min；（95℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s）30个循环；72℃、5 min。引物序列：正向引物5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3’；反向引物5’-GCTACGTTCTTCATCGAT-3’。

1.5 限制性内切酶酶切

酶切体系为20 μL：10×T Buffer（BSA free）2 μL；0.1% BSA 2 μL；PCR扩增产物12 μL；SmaⅠ（10 U/μL）1.5 μL；无菌超纯水2.5 μL。酶切反应体系在30℃水浴中孵育2 h。以无菌超纯水代替PCR扩增产物作为空白对照，其他操作均相同。

1.6 复方川贝散中川贝母灵敏度与检出限

采用等量递增法对川贝母粉和珍珠层粉进行混合进行灵敏度分析。设计川贝母含量分别为0%、5%、10%、20%、30%、40%共6个梯度进行PCR-RFLP实验。待确认灵敏度范围后采用PCR-RFLP进行第二次等量递增法确认灵敏度和检出限。川贝母样品采用组织破碎仪碎后使用（频率30次/秒，5 min）。DNA提取、PCR扩增及酶切操作按照“1.3”～“1.5”方法进行。

2 结果

2.1 复方川贝散和蛇胆川贝液PCR扩增及限制性酶切结果

复方川贝散和蛇胆川贝液PCR扩增后均出现特异性条带，但经SmaⅠ酶切后复方川贝散在100～250 bp之间出现两条特异性酶切条带，而蛇胆川贝液经SmaⅠ酶切后无特异性条带。见图1。

图1 复方川贝散和蛇胆川贝液PCR扩增及限制性酶切结果：A为复方川贝散和蛇胆川贝液PCR电泳结果；B为复方川贝散和蛇胆川贝液PCR产物限制性酶切电泳结果

2.2 复方川贝散中川贝母检测灵敏度

对川贝母含量为0%、5%、10%、20%、30%、40%共6个梯度样本进行实验发现川贝母含量为5%时，PCR扩增后可出现明显的特异性条带，见图2A。对上述6个梯度样本PCR扩增产物采用SmaⅠ酶切后发现川贝母含量为5%时，在100～250 bp之间得到两条特异性DNA条带，见图2B。

图2 复方川贝散中川贝母检测灵敏度检查：A为PCR扩增产物电泳图；B为限制性内切酶电泳图

2.3 复方川贝散川贝母检出限

以川贝母含量为1%、2%、3%、4%、5%共5个梯度进行PCR-RFLP实检测，发现川贝母含量为4%和5%时可得到特异性条带。对上述5个梯度样本PCR扩增产物采用SmaⅠ酶切后发现川贝母含量为4%和5%时，在100～250 bp之间得到两条特异性DNA条带。见图3。

图3 复方川贝散川贝母检出限：A为川贝母检测限PCR产物电泳图；B为川贝母检测限PCR产物SmaI酶切电泳图

3 讨论

复方川贝散具有止咳化痰、清热镇惊的药理活性，临床上可用于外感风热咳嗽或痰火郁结、肝火犯肺之久咳、痉咳等。复方川贝散是川贝母、浙贝母、珍珠制成的。川贝母由于资源少、价格高等原因，掺伪情况时有发生。由于中药制剂中的川贝母通常为打粉入药或提取物，故常规的显微鉴别、薄层鉴别方法或药师的经验鉴别存在较大的局限性。PCR-RFLP是基于川贝母含有SmaⅠ酶切位点的特有ITS序列进行分析的，具有特异性高和灵敏度高的优点。本研究也证实复方川贝散和蛇胆川贝液PCR扩增后均出现特异性条带，但复方川贝散经SmaⅠ酶切后在100～250 bp之间出现两条特异性酶切条带，而蛇胆川贝液经SmaⅠ酶切后无特异性条带，提示复方川贝散中含有川贝母而蛇胆川贝液中不含川贝母。PCR-RFLP方法应用于鉴别中药制剂中的川贝母可行。PCR-RFLP经过PCR扩增和限制性内切酶的酶切两步完成的，其中待检样本中DNA分子的完整性是进行有效鉴别的物质基础。复方川贝散属于散剂剂型，各成分未经过提取或化学手段处理，DNA分子相对较为完整，因此采用PCR-RFLP可以实现有效的鉴别。笔者同时也对部分含有川贝母成分的中药口服液进行了PCR-RFLP的实验，但均未获得有效的结果，推测可能是其中的DNA分子被破坏，无法进行有效的扩增所致。因此，PCR-RFLP方法鉴别中药制剂中的川贝母成分需确保川贝母DNA分子完整，否则可能会出现假阴性结果。

PCR-RFLP属于高灵敏度的检测方法。为进一步分析不同川贝母含量样本中的检测灵敏度，我们制备了川贝母含量为0%、5%、10%、20%、30%、40%的6个梯度样本进行了PCR-RFLP分析，结果证实川贝母含量为4%时PCR扩增产物采用SmaⅠ酶切后发现川贝母含量为5%时，在100～250 bp之间得到两条特异性DNA条带，提示PCR-RFLP可以对川贝母含量超过4%的样本进行有效的检测。但应当指出的是检测的灵敏度除了与川贝母的含量有关外，也与样本中DNA分子的完整程度以及制剂的制备工艺有关。同时，由于PCR-RFLP属于高灵敏度检测方法，若制剂的大量非川贝母中混有少量的川贝母成分，最终的检测结果也可能会表现为阳性。在以后的工作中我们将进一步探索对制剂中川贝母成分定性分析的方法，为市场监管提供技术支撑。