肌纤维发育相关基因在不同地方鸡种早期生长发育中的表达分析

董亚宁，王巧巧，李倩倩，苗秀秀，苏鹏程，刘丽英，李显耀*

(1. 山东农业大学动物科技学院(动物医学院)，山东 泰安 271018；2. 山东农业大学生命科学学院，山东 泰安 271018)

肌纤维作为肌肉的基本单位，其理化性质是影响鸡肉肉质的重要因素[1]。肌纤维生长发育与肌肉品质密切相关，在早期骨骼肌生长过程中，肌纤维的发育受多个基因的调控，包括肌生长抑制素基因(MSTN)、MRFs家族等，各基因相互作用调节肌肉发育，影响肌肉质量及肉品质。

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN，)又称生长和分化因子8(growth differentiation factor-8，GDF-8)，是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一，是骨骼肌生长的负调控因子，也可调节成肌细胞的细胞周期[2-3]，抑制成肌细胞的增殖和分化，对肌肉发育起关键作用。不同物种MSTN基因序列高度保守[4]，但在不同肌肉组织中的表达具有差异性。生肌调节因子(MRFs)家族包括生肌决定因子1(MyoD1)、肌细胞生成素(MyoG)、生肌调节因子5(Myf5)和生肌调节因子6(Myf6)4个转录因子[5-6]，具有组织表达特异性，在肌肉组织中高度表达[7]，并且不同肌肉组织中的表达同样具有差异性[8]。MRFs家族内各基因构成调控网络，在动物骨骼肌的发育中起关键的调控作用[9-10]，共同参与肌细胞的增殖和分化[11-13]。

山东省地方鸡品种丰富，生长速度和鸡肉品质存在差异。其中济宁百日鸡主产于山东省济宁市市中区，是蛋肉兼用型鸡品种，以高产著称，母鸡一般在100 d左右开始产蛋(因而得名“百日鸡”)。该品种适合散养，其肉质鲜美，食量小，体小早熟，耐粗抗病，觅食力强。鲁西斗鸡主要分布在山东西南部曹州一带，因其好斗而得名，是我国观赏性珍贵鸡种，该品种蛋白含量较高，有较高营养价值[14]。汶上芦花鸡产于山东省汶上县及相邻的梁山、任城等县市。该品种体型小，成熟早，产蛋率高而蛋小、耐粗饲、抗逆性和适应性强，遗传性能稳定[15]。

为了探讨鸡早期肌肉纤维发育的规律，本试验选择济宁百日鸡、汶上芦花鸡、鲁西斗鸡作为研究对象，分析了不同品种、不同周龄胸肌和腿肌Myf6、Myf5、MyoD1和MSTN等基因的mRNA表达水平，探索早期肌纤维发育时不同基因的表达调控规律，为以后山东地方鸡种选育和遗传资源的开发利用提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

1日龄济宁百日鸡、汶上芦花鸡、鲁西斗鸡分别来自山东百日鸡家禽育种有限公司、山东金秋农牧科技有限公司和鄄城鸿翔牧业有限公司，每个品种选择体重相近的公鸡36只，在相同环境中进行饲养。每个品种随机选择0 (1日龄)、1、2、3、4和5周龄各6只鸡进行屠宰，取左侧胸肌和腿肌的相同部位2 cm×1.5 cm样品，置于液氮中保存，用于提取RNA。

1.2 主要试剂和仪器

DNA Marker DM2000、TaqDNA Polymerase、dNTP等均购自康为世纪；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒购自瑞士Roche公司；荧光定量PCR仪(7500型)为美国ABI公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 引物设计

根据GenBank数据库中鸡的Myf6基因(登录号：ENSGALG00000010936)、MyoD1基因(登录号：ENSGALG00000006216)、Myf5基因(登录号：ENSGALG00000028091)、MSTN基因(登录号：ENSGALG00000039458)等基因序列，定量PCR引物采用Primer Premier 5.0软件设计，武汉擎科生物有限公司合成。引物序列见表1。

表1 基因的引物序列

1.3.2 肌纤维直径数据收集

制作石蜡切片，切片为6 μm，采用HE染色并在显微镜下对切片进行观察。选取切片的最佳部位，每张切片选取位置不少于5个。采用Image Pro Plus软件和Image J对图像进行处理，采集图像中的肌纤维直径指标。采集方法为：在图片中连续测量相邻的肌纤维，在5张图片中测量肌纤维不少于40根，测定后计算出平均值代表每个个体的肌纤维直径。

1.3.3 总RNA的提取及反转录

根据Invitrogen TRIzol的使用说明，分别用变性凝胶电泳和分光光度计DS-11(DeNovis，美国)提取各样品总RNA，并进行完整性和浓度的检测，置于-80 ℃备用。

按照试剂盒说明，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录为cDNA。反转录条件为：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

1.3.4 荧光定量PCR

采用SYBR Green 染料法，在荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系为20 μL：FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) 10 μL，PCR Forward primer 0.5 μL，PCR Reverse primer 0.5 μL， 灭菌双蒸水(ddH2O)7 μL，DNA模板(cDNA)2 μL。反应程序：预变性，50 ℃ 2 min；PCR反应，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；添加熔解曲线，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.4 数据统计与分析

以β-actin作为内参基因，实时荧光相对定量PCR所有数据均采用Livak等[16]的2-ΔΔCt法分析，数据以“平均值±标准差”表示。利用SAS软件ANOVA法进行方差分析，统计分析同一品种、不同周龄的胸腿肌中Myf6、MyoD1、Myf5和MSTN基因表达水平的差异，以及同一周龄、不同品种的表达量差异。

2 结果与分析

2.1 不同地方鸡种的肌纤维直径比较

济宁百日鸡、汶上芦花鸡、鲁西斗鸡的胸肌和腿肌肌纤维直径结果如图1所示，HE染色图略。随时间增加，胸腿肌肌纤维逐渐增大，5周龄时，3个品种鸡的胸腿肌肌纤维均达到最大，百日鸡胸肌、腿肌肌纤维平均直径分别为19.21和21.22 μm，斗鸡胸肌、腿肌肌纤维平均直径分别为22.00和24.30 μm，芦花鸡胸肌、腿肌肌纤维平均直径分别为20.40和21.85 μm。在0周龄(1日龄)时，鲁西斗鸡的胸肌肌纤维直径显著大于百日鸡和芦花鸡，百日鸡的腿肌肌纤维直径大于斗鸡，差异显著(P<0.05)。在1～4周龄时，百日鸡、芦花鸡和斗鸡胸腿肌的肌纤维直径增加强度均较大。在4周龄时，百日鸡和斗鸡胸肌肌纤维直径大于芦花鸡，斗鸡的腿肌肌纤维直径大于芦花鸡，差异显著(P<0.05)；在5周龄时，斗鸡胸肌、腿肌肌纤维直径均大于芦花鸡和百日鸡，差异显著(P<0.05)。

小写字母不同表示同一周龄不同品种间差异显著(P<0.05)，字母相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.2 不同地方鸡种的Myf6基因表达

2.2.1 Myf6基因在胸肌中的表达

济宁百日鸡、汶上芦花鸡、鲁西斗鸡胸肌Myf6基因在不同周龄的表达量存在差异，结果见图2A。Myf6基因在汶上芦花鸡、济宁百日鸡胸肌中表达呈先升高后降低的趋势。Myf6基因在汶上芦花鸡0～5周龄的表达量为1.429～2.501，4周龄时表达量显著高于其他周龄，约为1、2和3周龄的2倍(P<0.05)，0周龄最低，显著低于4周龄和5周龄(P<0.05)。Myf6基因在济宁百日鸡0～5周龄的表达量为0.929～2.607，3周龄表达显著高于其他周龄(P<0.05)，2、4和5周龄的表达量明显高于0周龄和1周龄(P<0.05)。Myf6基因在鲁西斗鸡0～5周龄的表达量为1.002～2.357，5周龄表达量显著高于0、1、2、3和4周龄(P<0.05)，约为0、1、2、3和4周龄时的2倍。

不同品种同一周龄间的Myf6基因表达水平显示，1周龄时，汶上芦花鸡Myf6基因的表达水平显著高于济宁百日鸡和鲁西斗鸡(P<0.05)；3周龄时，济宁百日鸡胸肌中Myf6基因的表达显著高于汶上芦花鸡和鲁西斗鸡(P<0.05)；4周龄时，汶上芦花鸡胸肌中Myf6基因的表达水平显著高于鲁西斗鸡和济宁百日鸡(P<0.05)；5周龄时，济宁百日鸡胸肌中Myf6基因的表达水平显著低于鲁西斗鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。

2.2.2 Myf6基因在腿肌中的表达

0～5周龄3个品种腿肌中Myf6的表达水平结果见图2B。Myf6基因在汶上芦花鸡腿肌中0～5周龄表达量为1.937～4.957，在0～4周龄时呈先增后减的趋势，2周龄时达到最大值；在2周龄时汶上芦花鸡腿肌Myf6基因表达水平显著高于其他周龄(P<0.05)，约为其他周龄的表达量的2倍。济宁百日鸡腿肌0～5周龄Myf6基因表达量分别为1.000～3.579，呈上升趋势，5周龄时表达量显著高于其他周龄(P<0.05)，达到0日龄的3.5倍。Myf6基因在鲁西斗鸡腿肌中各周龄的表达量无显著差异(P>0.05)。

大写字母不同表示同一品种不同周龄差异显著(P<0.05)。下同

0周龄时，鲁西斗鸡和汶上芦花鸡Myf6基因表达水平显著高于济宁百日鸡(P<0.05)，1周龄时，鲁西斗鸡和汶上芦花鸡Myf6基因明显高于济宁百日鸡(P<0.05)；2周龄时，汶上芦花鸡Myf6基因表达水平极显著高于济宁百日鸡和鲁西斗鸡(P<0.01)；5周龄时，济宁百日鸡腿肌中Myf6基因表达水平显著高于鲁西斗鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。

2.3 不同地方鸡种的MyoD1基因表达

2.3.1 MyoD1基因在胸肌中的表达

在0～5周龄时，3个品种胸肌中MyoD1的表达水平结果见图3A。MyoD1基因在济宁百日鸡胸肌0～5周龄表达量为0.27～0.663，0周龄表达量显著高于其他周龄(P<0.05)，是1、2、4和5周龄表达量的3倍；3周龄时的表达量显著高于1、2、4和5周龄(P<0.05)。MyoD1基因在鲁西斗鸡胸肌0～5周龄表达量分别为0.225～0.717，4周龄和5周龄的表达水平显著高于0周龄和2周龄(P<0.05)。汶上芦花鸡胸肌中MyoD1基因表达量0～5周龄分别为0.456～1.410，呈先增后降的趋势，3周龄时表达量最高，显著高于其他周龄(P<0.05)，4周龄时表达量显著高于1周龄时表达量(P<0.05)，约为1周龄表达量的2倍。

在0周龄时，MyoD1基因的表达水平在济宁百日鸡胸肌中显著高于鲁西斗鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)，汶上芦花鸡的表达水平显著高于鲁西斗鸡(P<0.05)；在2和3周龄时，MyoD1基因的表达水平在汶上芦花鸡胸肌中显著高于鲁西斗鸡和济宁百日鸡(P<0.05)；4周龄时，MyoD1基因的表达水平在汶上芦花鸡胸肌中显著高于鲁西斗鸡和济宁百日鸡(P<0.05)，鲁西斗鸡显著高于济宁百日鸡(P<0.05)；在5周龄时，MyoD1基因在汶上芦花鸡和鲁西斗鸡胸肌中的表达量明显高于济宁百日鸡(P<0.05)。

2.3.2 MyoD1基因在腿肌中的表达

0～5周龄时，3个品种腿肌中MyoD1的表达水平结果见图3B。MyoD1基因在汶上芦花鸡腿肌中0～5周龄表达量为0.677～1.225，济宁百日鸡腿肌中0～5周龄表达量为0.309～1.250，表达量呈先增后降趋势，MyoD1基因在汶上芦花鸡腿肌2、3、4和5周龄表达水平显著高于1周龄(P<0.05)，而2、3、4和5周龄之间无显著差异。济宁百日鸡腿肌MyoD1基因表达量在0周龄和2周龄时显著高于4和5周龄(P<0.05)，约为4和5周龄的2.5倍。MyoD1基因在鲁西斗鸡腿肌各周龄的表达量为0.272～1.742，4周龄的表达水平显著高于0、1、2和3周龄(P<0.05)，表达量约为2和3周龄的3倍，0周龄和1周龄的7倍。

图3 0～5周龄不同地方鸡种的胸肌(A)和腿肌(B)中MyoD1基因表达量比较

在0和2周龄时，济宁百日鸡和汶上芦花鸡腿肌中MyoD1基因的表达水平显著高于鲁西斗鸡(P<0.05)，汶上芦花鸡与济宁百日鸡无显著差异(P>0.05)。1周龄时，济宁百日鸡腿肌中MyoD1基因表达水平显著高于鲁西斗鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。在4周龄时，鲁西斗鸡腿肌中MyoD1基因表达水平显著高于济宁百日鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。5周龄时，MyoD1基因在济宁百日鸡腿肌中表达水平显著低于鲁西斗鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。

2.4 不同地方鸡种的Myf5基因表达

2.4.1 Myf5基因在胸肌中的表达

在0～5周龄时，3个品种鸡胸肌中Myf5的表达水平结果见图4A。济宁百日鸡胸肌中Myf5基因表达水平呈上升趋势，0～5周龄表达量为0.429～3.500，在3、4和5周龄的表达水平显著高于0、1和2周龄(P<0.05)。鲁西斗鸡胸肌Myf5基因在各周龄表达量为1.714～5.543，0周龄时表达水平显著低于1周龄(P<0.05)，显著高于5周龄(P<0.05)，1、2、3和4周龄的表达量为5周龄的3倍以上。Myf5基因在汶上芦花鸡胸肌中0～5周龄表达量分别为0.843～4.357，呈先增后减的趋势，2和4周龄的表达水平显著高于0、1、3和5周龄(P<0.05)。

在0、1和3周龄时，鲁西斗鸡胸肌中Myf5基因表达水平显著高于济宁百日鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。在2周龄时，鲁西斗鸡和汶上芦花鸡胸肌中Myf5基因表达水平显著高于济宁百日鸡(P<0.05)。5周龄时，济宁百日鸡胸肌中Myf5基因表达水平显著高于汶上芦花鸡和鲁西斗鸡(P<0.05)。

2.4.2 Myf5基因在腿肌中的表达

在0～5周龄时，3个鸡品种腿肌中Myf5的表达水平结果见图4B。在鲁西斗鸡腿肌中Myf5基因的表达水平呈先降后增的趋势，各周龄表达量为4.167～8.650；鲁西斗鸡腿肌中Myf5基因0、1和2周龄时表达水平较高，在3周龄时表达水平显著低于0、1、2和5周龄(P<0.05)；鲁西斗鸡腿肌中Myf5基因3周龄时表达水平约低于0、1和2周龄的1倍。Myf5基因在汶上芦花鸡腿肌中表达量为1.427～5.083，呈下降趋势，0周龄时表达水平最高且显著高于3、4和5周龄(P<0.05)，3、4和5周龄时表达水平约低于0周龄时表达量的2倍。在济宁百日鸡腿肌中Myf5基因表达水平呈上升趋势，0周龄时济宁百日鸡腿肌内Myf5基因表达水平显著低于3、4和5周龄(P<0.05)。

图4 0～5周龄不同地方鸡种的胸肌(A)和腿肌(B)中Myf5基因表达量比较

在0、1、2和5周龄时，鲁西斗鸡腿肌中Myf5基因表达水平明显高于济宁百日鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。在0周龄时，汶上芦花鸡胸肌中Myf5基因表达水平显著高于济宁百日鸡(P<0.05)。在3周龄时，3个品种鸡腿肌中Myf5基因表达水平无显著差异(P>0.05)。在5周龄时，济宁百日鸡腿肌中的表达水平显著高于汶上芦花鸡(P<0.05)。

2.5 不同地方鸡种的MSTN基因表达

2.5.1 MSTN基因在胸肌中的表达

在0～5周龄时，3个鸡品种胸肌中MSTN的表达水平结果见图5A。在济宁百日鸡胸肌中MSTN基因的表达水平整体呈上升趋势，0～5周龄表达量为0.762～6.569，4和5周龄时的表达水平显著高于0、1、2和3周龄(P<0.05)。在鲁西斗鸡胸肌中MSTN基因的表达量为1.064～6.002，4周龄时的表达水平显著高于其他周龄(P<0.05)。汶上芦花鸡胸肌中MSTN基因表达水平呈先增后降的趋势，表达量为0.759～3.949，1周龄时的表达水平显著高于其他周龄(P<0.05)。

图5 0～5周龄不同地方鸡种的胸肌(A)和腿肌(B)中MSTN基因表达量比较

在1周龄时，鲁西斗鸡胸肌中MSTN基因的表达水平显著低于济宁百日鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。2周龄时，鲁西斗鸡胸肌中MSTN基因的表达水平显著高于济宁百日鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。3和4周龄时，汶上芦花鸡胸肌中MSTN基因表达水平显著低于济宁百日鸡和鲁西斗鸡(P<0.05)，济宁百日鸡和鲁西斗鸡胸肌中MSTN基因表达水平无显著差异(P>0.05)。5周龄时，济宁百日鸡胸肌中MSTN基因表达水平显著高于鲁西斗鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)。

2.5.2 MSTN基因在腿肌中的表达

0～5周龄时，3个鸡品种腿肌中MSTN基因的表达水平结果见图5B。在济宁百日鸡腿肌中MSTN基因表达量0～5周龄为0.712～3.900，呈先增加后降低的趋势，4周龄时MSTN表达水平显著高于0、1、2、3和5周龄(P<0.05)，约为0、1、2、3和5周龄的3倍。鲁西斗鸡腿肌中MSTN基因表达量为0.735～5.250，大体呈先增后减趋势，4周龄时MSTN基因表达水平显著高于其他周龄(P<0.05)，其余周龄之间无显著差异。汶上芦花鸡腿肌中MSTN基因表达水平稳定，不同周龄间无显著差异(P>0.05)。

在0～3周龄时，3个鸡品种腿肌中MSTN基因表达水平无显著差异(P>0.05)。在鲁西斗鸡腿肌中4周龄MSTN基因表达水平显著高于济宁百日鸡和汶上芦花鸡(P<0.05)，济宁百日鸡中的表达水平显著高于汶上芦花鸡(P<0.05)。在5周龄时3个地方鸡种腿肌中MSTN基因表达水平差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

3.1 MRFs家族的表达调控

胚胎期Myf5和MyoD1基因调控骨骼肌发育，Myf5首先在前体肌细胞中表达，进一步调控MyoD1基因的表达。Myf5基因对鸡体重等生长性状和肌纤维的直径、密度等组织学性状有显著影响[17]。王鑫等[18]报道Myf5和MyoD1在绵羊不同组织中的表达显示，Myf5、MyoD1在肌肉组织中的表达量最高。

本试验中相同周龄不同种间比较，鲁西斗鸡胸腿肌中Myf5基因的表达水平高于汶上芦花鸡和济宁百日鸡，且鲁西斗鸡胸腿肌中MyoD1的表达水平在4周龄、5周龄时较高，由此，可以推测Myf5和MyoD1基因的表达在鲁西斗鸡发育早期影响骨骼肌的生长。3个鸡种胸腿肌中Myf5、MyoD1基因的表达模式不同，两者互相影响，共同调节骨骼肌发育。Myf5基因在汶上芦花鸡和鲁西斗鸡腿肌中表达水平呈下降趋势，这与张涛等[19]的研究一致。在本试验中，鸡发育早期，济宁百日鸡胸腿肌中Myf5基因表达趋势逐渐升高，MyoD1的表达趋势逐渐降低，推测可能是受MSTN基因调控的影响。

鸡肌肉Myf6基因主要是在出壳后受到Myf5调控，激活和表达后调控，并参与次级肌纤维的形成从而实现对肌肉的调控，其与肌纤维类型的转化有关。Myf6基因突变引起鸡肌纤维密度、直径和机体性状的改变[20]。本项研究的结果显示Myf5基因表达水平在3个地方品种出壳后胸肌中1～4周龄持续升高，其中汶上芦花鸡在2周龄时表达水平达到最高，Myf6基因的表达水平在4周龄时达到最高，可以推测出，Myf5基因可以激活Myf6的表达特别是在汶上芦花鸡中，从而参与肌纤维类型的转化。0～5周龄时，Myf6基因在3个地方鸡种的胸腿肌中的整体表达水平相近，其中表达规律不一致的地方可能是由于胸肌、腿肌起源的差异造成的，胸肌和腿肌分别是由轴下肌节的成肌细胞融合和肢芽处分化而成[21]。

3.2 肌肉生长抑制素MSTN基因的表达

MSTN基因对骨骼肌发育具有负调节作用。该基因在不同组织中表达差异，调控骨骼肌组织和脂肪细胞的增殖和分化[22]。在本试验中，0～4周龄，鲁西斗鸡胸肌中MSTN基因表达水平随日龄的增加而升高，表达量在4周龄时达到最高，与鲁西斗鸡胸肌中Myf5的表达趋势相反，与鲁西斗鸡胸肌中Myf6和MyoD1的表达趋势相同；济宁百日鸡胸肌中MSTN基因表达水平随日龄的增加而升高，但与MRFs基因表达水平的趋势变化没有明显关联。结果说明MSTN与Myf6和MyoD1的基因互作在鲁西斗鸡早期肌纤维的生长发育中发挥重要作用，这种互作可能与汶上芦花鸡和济宁百日鸡不同。汶上芦花鸡、济宁百日鸡和鲁西斗鸡腿肌中MSTN基因表达水平低于胸肌，猜测可能是由于腿肌运动量较高，从而使MSTN基因表达量降低。

4 结论

Myf5、Myf6、MyoD1和MSTN基因在3个地方鸡种中均呈现出不同的表达调控模式，Myf6和Myf5的互作在汶上芦花鸡胸肌中起重要作用；MSTN在胸肌、腿肌中表达模式不同，MSTN与Myf6和MyoD1的互作在鲁西斗鸡早期肌纤维生长发育过程中发挥重要作用。MSTN在汶上芦花鸡、济宁百日鸡和鲁西斗鸡腿肌中表达水平低于胸肌。本研究结果为地方鸡种的开发利用和分子标记辅助肉品质性状的选择提供了相关依据，基因间的具体互作方式还有待进一步研究。