云南省家禽弓形虫感染的流行病学调查及基因分型研究

李珂，刘欣超，赵津，严红亚，赵蓉，常志顺，王传禹，信爱国*，李祥瑞*

(1. 云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，云南 昆明 650224；2. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；3. 玉溪农业职业技术学院，云南 玉溪 653106)

弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的寄生于人和动物体内呈世界性分布的人畜共患寄生虫病，给世界各国的畜牧业造成巨大的经济损失，并危害人类健康，对孕妇和免疫缺陷、免疫抑制者损害尤其严重[1-2]。家禽主要通过食入或饮入含有弓形虫卵囊的食物和水而感染，且多呈隐性感染，人类通过接触病禽或食用未煮熟的禽制品可感染弓形虫，因此加强对家禽弓形虫感染的检测，对防控弓形虫病及人类健康有着重要的公共卫生学意义。近年来，国外报道了全球多个地区和国家散养鸡群弓形虫病流行情况，部分地区感染率达到80%以上[3-4]，国内散养鸡弓形虫病的感染情况各地存在一定的差异，但同样不容忽视[5-6]。云南省家禽遗传资源丰富，优质地方品种众多，而在云南部分地区仍保有生食的习惯，这就大大增加了人类感染弓形虫的风险。通过对云南省人弓形虫感染情况的调查发现，从事畜禽养殖相关的职业人群弓形虫阳性率明显高于非职业人群[7-8]。玉溪地区也报道了鸽子弓形虫感染情况[9]，但关于云南家禽弓形虫感染情况的报道和基因型研究尚十分欠缺。为了解云南省家禽弓形虫的感染情况，采用间接血凝(IHA)和套式PCR两种方法对云南省5个区域的8个规模化家禽养殖场、10个地方鸡养殖场及部分散养户进行了弓形虫检测，并对核酸检测为阳性的样品进行了PCR-RFLP基因分型研究，以期为云南省家禽弓形虫病的防控提供数据支持和参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源及抽样方法

2018年3月至2020年12月，从云南省昆明、玉溪、楚雄、昭通、文山、开远、建水、绿春、西双版纳、普洱、大理、丽江、迪庆等地区的8个规模化家禽养殖场(4个标准蛋鸡场、3个标准肉鸡场和1个标准种鸭场)、10个地方品种鸡(南涧乌骨鸡、尼西鸡、云龙矮脚鸡、绿春黄连鸡、宁蒗高原鸡、武定鸡、文山土鸡、盐津乌骨鸡、茶花鸡、瓢鸡)养殖场和部分散养户(土杂鸡、散养鸭、鹅、鸽子)，翅静脉采集各种家禽血样，并采集养殖场土壤样品。

按照估计流行率方法进行抽样。参考国内相关报道结果，设置信水平95%，可接受误差10%，预期流行率10%，综合考虑各养殖场(户)饲养规模，在各场(户)采取随机抽样的方式，共采集样品2 802份，其中血液样品2 145份，土壤样品657份，于-80 ℃冰箱保存备用。各地区及养殖场(户)样品采集情况见表1。

表1 各地区及养殖场(户)样品采集数

1.2 主要试剂

弓形虫间接血凝抗体检测试剂盒，购自中国农业科学院兰州兽医研究所；国际标准强毒株RH株速殖子DNA，为南京农业大学动物医学院寄生虫组李祥瑞教授惠赠；土壤DNA提取试剂盒，购自Omega 公司；血液/组织DNA提取试剂盒及DNA切胶回收试剂盒，购自天根公司；Taq酶、dNTP Mixture等PCR所需试剂，购自TaKaRa公司；内切酶，购自NEB公司。

1.3 方法

1.3.1 抗体检测

参照弓形虫间接血凝抗体检测试剂盒的说明书进行检测，当阳性对照血清、阴性血清对照和稀释液对照成立的前提下，以待检血清抗体滴度等于或高过1∶64为判断阳性标准。

1.3.2 核酸检测

使用DNA提取试剂盒提取样品(包括采集的土壤样品，以及抗体检测结果为阳性的血液样品)DNA后，根据杨振[10]设计的弓形虫ITS-1序列特异性引物对所有样品进行检测。引物序列：ITSa：5′-TGAATCCCAAGCAAAACAT-3′，ITSb：5′-GGAAGCAATCTGAAAGCAC-3′。引物由广州擎科生物科技有限公司合成，目的片段大小为341 bp。

PCR反应体系为25 μL，其中10× buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，MgCl21.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板3 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 8 min。扩增结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 PCR-RFLP基因分型

将核酸检测结果为阳性的样品DNA与国际标准强毒株RH株速殖子DNA一起，使用表面抗原SAG3基因的PCR-RFLP[11](表2)进行分型分析，反应体系为25 μL，其中10× buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 16.3 μL。第一轮反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min；第二轮反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min。扩增结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 多位点基因分型 PCR-RFLP 所用引物序列及内切酶

将SAG3基因扩增结果为阳性的PCR产物切胶回收后，用相应的内切酶37 ℃金属浴30 min，酶切体系为：内切酶0.5 μL，10× buffer 2 μL，产物10 μL，ddH2O 7.5 μL，共计20 μL。酶切结束后，3%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 数据统计与分析

将检测结果录入Excel，按家禽种类、品种和区域分别进行统计和描述，分析不同养殖类型、不同种类、不同品种和不同区域的家禽弓形虫感染情况，并对多位点基因分型 PCR-RFLP结果进行综合分析，从而系统了解云南省家禽弓形虫病的流行状况。

2 结果与分析

2.1 不同养殖类型家禽及环境中弓形虫感染的检测

将采集的规模化养殖场、地方品种鸡养殖场和家禽散养户的2 145份血样通过弓形虫间接血凝抗体试剂盒进行检测，并将抗体检测为阳性的血样和657份土壤样品，通过PCR方法进行了弓形虫ITS-1检测，并以已知的无弓形虫感染样品和RH株样品为阴、阳性对照，部分样品PCR产物电泳见图1。

M.DNA标准分子量DL2000；1.阳性对照(RH株)；2.阴性对照；3～24.部分样品

按照不同养殖类型对弓形虫检测结果进行统计，结果见表3。不同养殖类型弓形虫阳性率差异明显，规模化养殖场抗体、核酸检测均为阴性；散养场(户)平均抗体阳性率为6.98%，血样、土壤的核酸平均阳性率分别为2.18%和3.42%，其中，散养鸡最高，抗体阳性率达到9.30%，血样、土壤核酸阳性率达到4.32%和6.96%，地方鸡和其他家禽阳性率差异不大。

表3 不同养殖类型场(户)弓形虫检测结果

2.2 不同品种家禽及环境中弓形虫感染的检测

此次弓形虫流行病学调查涵盖了云南省主要家禽(鸡、鸭、鹅、鸽)和10个云南地方品种鸡，不同家禽和不同地方品种鸡之间的阳性率存在差异，结果见表4、表5。不同家禽中鸽子平均抗体阳性率最高为6.41%，鸭最低为4.10%。各家禽血样的核酸平均阳性率差异不大，土壤除鹅未检出外，从高到低依次为鸽子(3.70%)、鸡(3.04%)和鸭(1.56%)；不同地方品种鸡中武定鸡和文山土鸡较高，分别为8.43%、8.25%，绿春黄连鸡最低为3.85%，其余鸡种均高于5%。不同品种的核酸平均阳性率，南涧乌骨鸡、尼西鸡、云龙矮脚鸡和绿春黄连鸡均为血样、土壤检测阴性，瓢鸡为土壤检测阴性。血样中文山土鸡最高(4.12%)，茶花鸡和武定鸡次之(2.56%、2.41%)，瓢鸡、盐津乌骨鸡、宁蒗高原鸡相近(1.96%、1.12%、1.69%)；土壤中茶花鸡最高(4.17%)，文山土鸡、盐津乌骨鸡、宁蒗高原鸡、武定鸡相近(3.85%、3.70%、3.57%、3.03%)。

表4 不同种类家禽弓形虫检测结果

表5 不同地方品种鸡弓形虫检测结果

2.3 不同地区家禽及环境中弓形虫感染的检测

将所检测样品按照所属地区进行统计，结果见表6、表7。总体来看，滇东南平均抗体阳性率(6.60%)和血样核酸平均阳性率(3.55%、5.38%)均为最高，滇西南(6.02%、2.78%、3.37%)仅次于滇东南，而滇中地区血样的抗体阳性率(3.34%)和核酸阳性率(0.61%)均为最低，土壤的核酸阳性率，则是滇东北(1.30%)和滇西北(1.52%)较低；将各地区的散养家禽进行对比发现，平均抗体阳性率滇中(12.22%)、滇南(9.87%)地区远高于其他地区，血样、土壤的核酸平均阳性率，滇东南(3.55%、5.38%)、滇南(3.29%、5.77%)和滇西南(2.78%、3.37%)地区较高。

表6 不同地区家禽弓形虫检测结果

表7 不同地区散养家禽弓形虫检测结果

2.4 PCR-RFLP基因分型分析

48份(30份血清样品、18份土壤样品)经过ITS-1序列特异性检测为阳性的样品，进一步与RH株速殖子进行表面抗原SAG3基因的PCR-RFLP，结果显示：除1份土壤样品的基因型为非典型以外，其余核酸阳性样品的基因型均为Ⅰ型，占97.92%(47/48)，部分样品的PCR产物电泳见图2，酶切图见图3。

M.DNA标准分子量DL2000；1.阳性对照(RH株)第一轮扩增；2.阳性对照(RH株)第二轮扩增；3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23.样品第一轮扩增；4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24.样品第二轮扩增

M.DNA标准分子量DL500；1.阳性对照(RH株)；2～10.样品

3 讨论

随着我国经济持续高速发展，人民生活水平得到提高，对肉制品的需求比重逐步发生变化，禽肉制品成为了人们餐桌上肉食的重要来源。弓形虫作为重要的人兽共患寄生虫病，制约了家禽业的发展，并对人类的健康构成了威胁。本文调查了2018—2020年云南省家禽饲养比较集中地区的标准化养殖场、地方品种鸡养殖场和散养户中家禽弓形虫病的流行情况及环境污染情况，调查结果表明，2 145份血液样品的弓形虫平均抗体阳性率为4.48%(96/2 145)，核酸平均阳性率为1.40%(30/2 145)，657份土壤样品的弓形虫核酸平均阳性率为2.74%(18/657)，其中散养场(户)平均抗体阳性率为6.98%，血样、土壤的核酸平均阳性率分别为2.18%和3.42%，而规模化养殖场均未检出阳性样品。分析原因可能与规模化养殖场基础设施完善，饲养管理水平较高有关系，规模化养殖场多采用全封闭式或半封闭式饲舍，配套有防鸟、捕鼠设施，除定期进行消杀驱虫外，饲养人员和饲养用具进出生产区严格执行消毒规范，并严禁饲养犬、猫等宠物，避免了这类弓形虫的重要寄生宿主带虫引起的传播；而散养场(户)的基础设施和饲养水平层次不齐，且多为开放式或半开放式饲养，增加了与野鸟、犬、猫等动物的接触机会，消杀驱虫难度大，感染机会较大。

从不同种类家禽、不同地方品种鸡和不同地区对检测结果进一步分析，鸽抗体阳性率最高(6.41%)，鸭最低(4.10%)，鸡略高于鸭(4.38%)，土壤核酸阳性率鸽子(3.70%)高于鸡(3.04%)和鸭(1.56%)，鹅未检出。最主要的原因可能是鸽多采取半放养模式进行饲养，增加了接触到带虫野鸟、野生动物及其排泄物的机会，鸡在家禽饲养中技术最成熟，养殖量大，但饲养模式多级分化；不同地方品种鸡中，抗体阳性率武定鸡(8.43%)和文山土鸡(8.25%)较高，绿春黄连鸡(3.85%)最低，血样、土壤的检测，文山土鸡(4.12%)和茶花鸡(4.17%)最高，南涧乌骨鸡、尼西鸡、云龙矮脚鸡、绿春黄连鸡均未检出，瓢鸡只在血样中检出。此次调查的地方品种鸡样品均采自种鸡场，种鸡主要收购于农户手中，多有与犬、猫混养的习惯，鸡只通过啄食受到污染的饲料和饮水而遭受感染，种鸡场虽经过简单筛选，但饲养管理水平较规模化养殖场低且参差不齐，再加之各种鸡所处地区气候、温湿度等条件的影响，也是造成此结果的重要原因；不同地区的检测结果显示，滇东南阳性率(6.60%、3.55%、5.38%)最高，其次为滇西南(6.02%、2.78%、3.37%)，但将散养家禽单独比较后发现，滇中、滇南地区平均抗体阳性率(12.22%、9.87%)远高于其他地区，血样、土壤的核酸平均阳性率滇东南(3.55%、5.38%)、滇南(3.29%、5.77%)和滇西南(2.78%、3.37%)较其他地区高，可能与这些地区的气候条件、生态环境及规模化养殖程度有关，其中滇东南、滇南和滇西南地区气温相对较高、生态环境较好，与带虫野生动物接触的概率较高，滇中、滇西、滇南地区为云南省家禽饲养较集中区域，饲养量和密度大，饲养模式呈多级分化，标准化、规模化生产与家庭散养式、山林放养式兼有，而滇东北和滇西北地区海拔较高，气温较低，养殖量也相对较少。

PCR-RPLP多态性分析技术广泛应用于对不同宿主源的弓形虫进行基因分型，通过该技术可将弓形虫虫株分为3个基因型谱系(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)。为了更好地了解云南省家禽弓形虫的流行状况，本调查对48份经过ITS-1序列特异性检测为阳性的样品，运用PCR-RFLP方法对表面抗原SAG3基因进行了基因分型研究，同时设立Ⅰ型弓形虫代表株RH株为阳性对照。结果表明，此次检测的云南省家禽血清及环境样品中的弓形虫基因型主要是Ⅰ型，占97.92%(47/48)，1份土壤样品为弓形虫非典型基因型。国内许多学者对我国不同来源弓形虫的基因型研究证实，Chinese1型为流行我国的优势基因型[12-13]，而根据弓形虫数据库(www.toxodb.org)和相关研究关于 Chinese1型在 SAG3位点基因型的报道，SAG3基因位点是Ⅲ型，与本研究结果不一致，但与王瑞彪[11]对泰安市商品性鸡产品弓形虫基因分型的研究结果一致，若要探究鸡源弓形虫是否属于另一基因型，仍需进一步对其他基因位点进行研究。

临床上家禽弓形虫病相对于哺乳动物来说比较罕见，多呈隐性感染，主要通过血液循环到达到宿主各脏器和组织，侵入有核细胞，因此血清学检测与PCR方法的联合使用，能更好地反映家禽弓形虫的感染情况。近年来，我国一些省市报道了禽类弓形虫感染情况[5-6,14-16]，然而关于云南省家禽弓形虫流行状况及基因型的研究尚十分欠缺。通过本次调查发现，云南省家禽中普遍存在弓形虫感染的情况，且环境污染情况不容乐观，不同饲养模式、不同品种、不同地区之间存在差异，散养场(户)的阳性率明显高于规模化养殖场，鸽子由于其饲养方式特点，阳性率高于其他家禽，不同地方品种鸡及不同地区弓形虫的感染情况与该地区气候特点、饲养方式及水平存在一定的关联。建议加强饲养管理，场区严禁饲养犬、猫等宠物，做好防鸟灭鼠工作，避免饲料及饮水污染，尤其对于散养的家禽应定期开展驱虫，并特别关注相关从业人员健康状况，禁食生肉制品，切断传播途径，具有重要的公共卫生学意义。