河南省部分屠宰场生猪肉孢子虫感染情况调查

杨红玉，张敏，马超锋，闫文朝

(1. 南阳农业职业学院，河南 南阳 473000；2. 焦作市动物疫病预防控制中心，河南 焦作 454150；3. 信阳市动物疫病预防控制中心，河南 信阳 464000；4. 河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471023)

肉孢子虫病是由肉孢子虫(Sarcocystis)寄生于多种宿主的肌肉而引起的一种人兽共患原虫病，猪、牛、羊和鸟类等多种动物均可感染。肉孢子虫属于孢子虫纲、真球虫目、肉孢子虫科。肉孢子虫属有200多个虫种，不同虫种的中间宿主和终末宿主也存在差异。一些虫种感染动物后不表现明显症状，而有些虫种可对中间宿主表现明显致病性，引起动物贫血、发热、嗜酸性粒细胞肌炎、流产或者死亡。人因食用含有虫体的肉制品主要是猪肉而感染，出现发热、恶心、呕吐和腹泻等症状[1-2]。因此，开展猪的肉孢子虫调查和研究具有重要的经济价值和公共卫生意义。

猪是肉孢子虫的中间宿主。根据报道，猪有3种肉孢子虫，米氏肉孢子虫(S.miescheriana)、猪人肉孢子虫(S.suihominis)和猪猫肉孢子虫(S.porcifelis)，其中米氏肉孢子虫和猪人肉孢子虫流行最为广泛且致病性最强，曾引起猪场肉孢子虫病暴发，给养猪业带来较大危害和损失[1，3]。本研究采用刘婕等[4]开发的猪源肉孢子虫双重套式PCR检测试剂盒对河南省11个地市62家屠宰场开展生猪肉孢子虫感染情况调查，以期掌握河南省猪的肉孢子虫感染情况，为该地区肉孢子虫病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品的采集及处理

2018年6月—2019年10月，在河南省11个地市62个屠宰场采集膈肌样品2 038份，每份5～8 g，登记样品来源(年存栏大于500头为规模场，少于500头为散养户)，冷藏带回实验室，统一编号登记，置-20 ℃冰箱保存备检。

1.2 主要检测试剂

普通Taq聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、10×缓冲液、琼脂糖等购自大连宝生物工程有限公司；组织细胞DNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；猪源肉孢子虫双重套式PCR检测试剂盒由河南科技大学动物科技学院动物检疫实验室提供。

1.3 主要试验仪器

全自动样品快速研磨仪(上海净信实业发展有限公司)；5424R高速台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；LC-800低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；核酸提取仪(西安天隆科技有限公司)；PCR仪(德国Biometre公司)；Eppendorf 不同量程单道移液器及25～300 μL多道移液器(德国Eppendorf公司)；电泳仪、凝胶成像系统(以色列DNA公司)；HH数显恒温水浴锅(江苏金坛晶玻实验仪器厂)等。

1.4 引物的设计与合成

参考文献[4]的报道米氏肉孢子虫和猪人肉孢子虫特异引物(如表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 猪源肉孢子虫双重套式PCR检测引物

1.5 检测方法

将采集的样品剪成小块放入离心管中，随后加入液体在全自动样品快速研磨仪上制成匀浆；采用组织细胞DNA提取试剂盒提取处理过样品的总DNA，操作方法参照试剂盒说明书进行；将提取的总DNA作为模板，采用文献[4]建立的肉孢子虫双重套式PCR方法对待检样品进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，米氏肉孢子虫和猪人肉孢子虫扩增产物的大小分别为415和591 bp。

反应条件：第一轮扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35 个循环；72 ℃ 10 min。第二轮PCR 扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。

1.6 检测数据分析

结果采用SPSS 19.0软件进行分析，分别对不同地区屠宰场肉孢子虫场阳性率和样品阳性率、不同规模猪群肉孢子虫阳性率、不同季节屠宰场肉孢子虫阳性率进行χ2检验分析差异显著性，P<0.05时差异显著，P<0.01差异极显著。

2 结果与分析

2.1 河南省屠宰场肉孢子虫总体感染情况

从图1可以看到，本次调查中发现的只有米氏肉孢子虫(415 bp)。本次检测调查河南省11个地市的62个屠宰场，肉孢子虫阳性场37个，平均场阳性率为59.7%，最高的为驻马店、商丘和郑州，均为66.7%，其次为信阳，为62.5%；场阳性率最低的为安阳和漯河，阳性率均为33.3%。2 038份样品的平均阳性率为29.4%，南阳、驻马店、信阳、郑州、周口和新乡样品阳性率均超过30%，周口样品阳性率最高，为37.1%；阳性率最低为漯河和安阳，分别为为10.5%和11.1%(见表2)。χ2检验分析表明，河南不同地区屠宰场肉孢子虫场阳性率差异不显著(P>0.05)，不同地区间样品阳性率均差异极显著(P<0.01)。

表2 样品来源及抗体阳性率

M．DL2000 DNA Marker；1～6.被检样品；7.阳性对照；8.阴性对照

2.2 河南省不同规模猪场肉孢子虫感染情况

本次调查根据猪的来源，分为规模场(存栏500头以上)和散养户(存栏500头以下)。从表3可以看出，散养户的肉孢子虫阳性率(32.3%)略高于规模场(27.7%)。χ2检验分析表明，不同规模猪场肉孢子虫阳性率差异显著(P<0.05)。

表3 不同场点类型猪场肉孢子虫感染率

2.3 河南省屠宰场不同季节猪肉孢子虫感染情况

本次屠宰场生猪肉孢子虫感染调查，每个季节均有阳性检出，其中，春季最高，达到33.8%，冬季最低为26.1%(见表4)。χ2检验分析表明，不同季节猪群肉孢子虫阳性率差异不显著(P>0.05)。

表4 屠宰场不同季节肉孢子虫感染率

3 讨论

肉孢子虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，感染后会对人体健康造成一定的危害。牛、羊、猪等动物是肉孢子虫传播的中间宿主，与人类密切接触，因此查清肉孢子虫的感染状况，有重要公共卫生意义。猪肉因其较高的营养价值而为人们所喜爱，我国每人年平均猪肉消费量为27.1 kg(2019年)，猪肉是国人餐桌的主要肉类。2019全年，河南省生猪出栏量达3 170万头，对屠宰生猪开展肉孢子虫感染调查有重要的公共卫生意义。本次共调查11个地区的62个屠宰场，场阳性率为59.7%，样品阳性率为29.4%；这与曹谦[5]调查的青海同仁县隆务地区猪感染率83.15%，冯成兰等[6]调查的青海共和地区屠宰生猪感染率61.91%，周伟业[7]调查的青海冷湖地区的感染率47.34%，王荣菊等[8]调查的青海西宁屠宰场猪感染率44%相比，都要低；与薛瑞等[9]2018年调查的河南洛阳猪源肉孢子虫感染率26.8%接近；远高于李明伟等[10]对湛江市猪肉孢子虫调查的感染率2.05%，张浩吉等[11]对广州地区猪肉孢子虫调查的感染率0.7%，李小军等[12]对河南豫北地区猪肉孢子虫调查的感染率0.238%。需要说明的是以上调查所采用的方法均是镜检压片法，检测结果靠主观判断，与检测者水平有较大关系，存在一定误差。周望平等[13]采用ELISA 方法对湖南地区开展猪肉孢子虫病血清学调查，感染率为4.4%，低于本次调查的感染率。本次调查肉孢子虫感染情况采用的双重套式PCR检测方法，具有敏感、特异和快捷等优点，可以实现对猪肌肉组织和血液等样品中肉孢子虫的快速、准确检测，可以为猪肉孢子虫病诊断和流行病学调查提供高效的检测手段和方法，可以大范围推广应用。

本次调查将根据屠宰场猪的来源，将猪群划分为规模场和散养户，均有肉孢子虫阳性检出，说明不同场点猪场均有感染，分析散养户阳性率高于规模场可能与规模场大多集约化养殖，有效切断了中间宿主与终末宿主的联系有关。从本次调查结果来看，河南省猪群一年四季均有肉孢子虫感染，但是不同季节感染率有差异，春季感染率最高，夏季、秋季和冬季感染率较接近，其中冬季感染率最低。当前还没有特效药物治疗肉孢子虫病，防治肉孢子虫病主要采取综合性防控措施切断传播途径：一是猪场禁止饲养犬猫，犬猫作为肉孢子虫的终末宿主，在肉孢子虫的感染中起到重要作用；二是病死动物及时处理，禁止用生肉或者下水饲喂犬猫等动物。