高效液相色谱指纹图谱评价泻白散及其3 种单味药内在质量

张会敏，杨宗统，苏本正，李晓晶，刘瑾，李群，隋在云

（山东省中医药研究院，济南 250014）

泻白散出自宋代钱乙的《小儿药证直决》［1］，收录于2018 年中国中医药管理局下发的《古代经典名方目录（第一批）》［2］。泻白散由桑白皮（炒黄）、地骨皮、炙甘草和粳米组成，为煮散剂，具有清泄肺热，止咳平喘之功效。其中，桑白皮［3］为生长数十年的桑树除去外表粗皮的干燥根皮，其内在质量受生长年限影响较大。目前地骨皮［4］主要为野生资源，其内在质量受生长环境影响较大。甘草［5］多为栽培品，生长时间多为2～3 年，其内在质量相对稳定。粳米的主要成分为淀粉和蛋白质，有无粳米对泻白散的特征图谱无影响［6］。鉴于市售桑白皮、地骨皮药材质量受生长年限等因素影响较大，内在质量参差不齐，开展经典名方泻白散指纹图谱研究，以评估泻白散组方中来自全国不同地区市售炒桑白皮、地骨皮、炙甘草的内在质量具有重要意义。

黄梦婷等［7］分析了桑白皮炮制前后指纹图谱和色度值的差异性；曹斯琼等［8］标定了桑白皮14个共有峰；董丹华等［9］对不同产地的15 批次地骨皮药材进行研究，确定了4 个特征峰；陈倩倩等［10］对47 批次地骨皮饮片进行质量分析，发现不同厂家的地骨皮质量差异较大；赵晓玲等［11］测定并比较不同来源地骨皮药材（包括野生、栽培和市售）中地骨皮甲素、乙素和阿魏酸的含量，发现不同产地地骨皮各成分差异较大。自2018 年《古代经典名方目录（第一批）》发布以来，对目录中经典名方的研究逐渐增多［12-14］，但对泻白散高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的研究相对较少，王彦帅等［15］在泻白散的共有峰中指认了桑皮苷A、甘草苷、甘草酸铵3 种物质；王彦等［16］在泻白散物质基准的指纹图谱中，归属了10 个特征峰，其中2 个来自炒桑白皮、4 个来自焙地骨皮、4 个来自炙甘草。为了摸清市售炒桑白皮、地骨皮、炙甘草内在质量，保证泻白散临床用药质量及疗效，笔者建立HPLC 指纹图谱方法并指认3 种单味药的成分，对全国不同地区市售炒桑白皮、地骨皮、炙甘草进行内在质量评价，以期为泻白散经典名方的质量标准制定及临床用药提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：2690／5 型，配备2996 DAD检测器、全自动进样器、高效液相色谱工作站，美国Waters 公司。

电子分析天平：XS205DU 型，感量为0.000 1 g，瑞士梅特勒-托利多公司。

桑白皮、地骨皮、炙甘草样品：从全国各地收集桑白皮、地骨皮、炙甘草各13 批样品，经山东省中医药研究院中药资源研究室鉴定均为《中国药典》正品。桑白皮按照2015 年版《浙江省中药炮制规范》照清炒法炮制成炒桑白皮。13 个泻白散组方及样品信息见表1。

表1 泻白散组方及样品信息

桑辛素、甘草酸、异甘草素、桑皮苷A、地骨皮乙素、芹糖甘草苷、甘草素、异甘草苷、甘草苷、绿原酸对照品：含量（质量分数）均大于96%，批号分别为P 0 9 J 7 F 8 7 6 7、P 3 1 J 9 F 6 6 9 6 6、Z 0 2 M 3 L 1、P12M9L61177、P22F10F81304、R03A9F67328、Z20J8X40265、R07D8F50056、Z10J8X39611、Y24J7K16726，上海源叶生物科技有限公司。

甘草酸铵、东莨菪内酯、大黄素对照品：含量（质量分数）均大于96%，批号分别为110731-201720、110768-200504、110756-201913，中国食品药品检定研究院。

乙腈、甲醇：均为色谱纯，美国BCL 公司。

磷酸：分析纯，天津市科密欧试剂公司。

中药指纹图谱相似度评价系统软件：2004A 版，国家药典委员会。

实验用水：纯净水，屈臣氏集团（香港）有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Thermo Syncronis C18柱（250 nm×4.6 mm，5 μm，美国赛默飞世尔科技有限公司），填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；检测器：二级管阵列检测器；柱温：30 ℃；流量：1 mL／min；检测波长：254 nm，进样体积：5 μL；分析时间：120 min；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

1.3 溶液制备

1.3.1 对照品溶液

精密称取桑辛素、甘草酸、异甘草素、桑皮苷A、地骨皮乙素、芹糖甘草苷、甘草素、异甘草苷、甘草苷、绿原酸、甘草酸铵、东莨菪内酯、大黄素对照品适量，用甲醇配制成质量浓度分别为30、82、53、65、60、20、95、100、77、85、80、165、38 μg／mL 的 对 照品溶液。

1.3.2 供试品溶液

按照《小儿药证直诀》中泻白散配比，取适量炒桑白皮、地骨皮、炙甘草，粉碎，过孔径为（250±9.9）μm（65 目）筛，混合均匀，制成试验用泻白散粉末。精密称取1.00 g 泻白散粉末，加水至30 mL，回流提取1 h，放冷，补重，以3 000 r／min 离心5 min，过滤上清液，取续滤液10 mL，按照体积比为1∶1 加入甲醇，混匀，静置过夜，过滤上清液，滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，得泻白散供试品溶液，备用。同法分别制备不同批次的泻白散、炒桑白皮、地骨皮、炙甘草供试品溶液。

1.4 实验方法

采用高效液相色谱法，按1.2 色谱条件测定泻白散及其3 种单味药饮片样品溶液，得到各批泻白散、单味药高效液相色谱指纹图谱，计算各批泻白散样品之间、单味药样品之间、对照品与泻白散样品之间指纹图谱的相似度，对泻白散中的共有色谱峰进行指认。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

分别考察了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液系统对测定结果的影响，结果发现乙腈-0.1%甲酸水溶液条件下色谱峰分离度较好，基线稳定，故选择乙腈-0.1%甲酸水溶液进行优化梯度洗脱条件；分别比较60、100、120、150 min 的检测时间对测定结果的影响，结果发现120、150 min 均可检测出泻白散中所有的色谱峰，为节省时间，选择检测时间为120 min；采用DAD-UV 检测器对200～400 nm 检测波长进行考察，发现在254 nm 波长下，色谱峰最多，泻白散信息量最大，最终选择检测波长为254 nm。

2.2 料液比的优化

《小儿药证直诀》记载泻白散制法［5］及用法“上锉散，入粳米一撮，水二小盏，煎七分，食前服”，依据《浙江省中药炮制规范》（2015 年版）确定炒桑白皮工艺为取桑白皮饮片，照清炒法炒至表面微黄，微具焦斑时，取出摊凉。参考王彦帅等［6］确定的经典名方泻白散物质基准制备工艺：取炒桑白皮3.93 g，焙地骨皮3.93 g，炙甘草0.39 g，粳米1.50 g，加水360 mL 煎煮，料液比约为1∶37。遵循古代经方制法、煎煮原则，分别将炒桑白皮、地骨皮、炙甘草粉碎，过孔径为（250±9.9） μm 筛，进行加热回流提取，最终确定料液比为1∶30，较为接近古代煎煮工艺。

2.3 方法学验证

2.3.1 精密度试验

取桑皮苷A 对照品溶液，在1.2 色谱条件下连续进样6 次，记录色谱峰面积。结果显示，测定结果的相对标准偏差为0.21%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取泻白散组方X10 样品，按1.3.2 制备样品溶液，在1.2 色谱条件下，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样6 次，记录色谱峰面积。结果显示，色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.25%～1.02%，其中各主要色谱峰保留时间无明显变化，测定结果的相对标准偏差为0.01%～1.21%，表明样品稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取泻白散组方X10 样品，按1.3.2 制备样品溶液6 份，在1.2 色谱条件下各进1 次，记录色谱峰面积。结果显示，色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.25%～2.85%，其中各主要色谱峰的保留时间无明显变化，测定结果的相对标准偏差为0.13%～1.56%，表明该方法的重复性良好。

2.4 HPLC 指纹图谱的建立

2.4.1 炒桑白皮指纹图谱测定

将13 批全国不同饮片企业市售桑白皮炒制品（S1～S13）按照1.3.2 制备供试品溶液，在1.2 色谱条件下测定，将色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统软件（2004A 版），HPLC 指纹图谱匹配结果见图1。由图1 可知，13 个批次之间的相似度为0.024～0.975，差别非常大，炒桑白皮样品S8 中，各成分的含量非常低，虽然外观性状符合炒桑白皮正品特征，但内在质量非常差，推测该样品可能存放时间太久所致。除S8 炒桑白皮样品外，其它12 批炒桑白皮仅有7 个共有峰。

图1 13 批炒桑白皮指纹图谱匹配图

2.4.2 地骨皮指纹图谱

将13 批全国不同饮片企业市售地骨皮（D1～D13）按照1.3.2 制备供试品溶液，在1.2 色谱条件下测定，将色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统软件（2004A 版），HPLC 指纹图谱匹配结果见图2。由图2 可知，13 个批次之间的相似度为0.061～0.983，差别非常大，地骨皮样品D11、D12、D13 与其它样品的相似度非常低，D12、D13 色谱峰数量及分布与其它地骨皮样品差别较大，虽然外观性状均符合地骨皮正品特征，但内在质量差异较大。13 批地骨皮仅有4 个共有峰。

图2 13 批地骨皮指纹图谱匹配图

2.4.3 炙甘草指纹图谱

将13 批全国不同饮片企业市售炙甘草（G1～G13）按照1.3.2 制备供试品溶液，在1.2 色谱条件下测定，将色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统软件（2004A 版），HPLC 指纹图谱匹配结果见图3。由图3 可知，结果显示，13 个批次之间的相似度为0.978～0.998，相似度非常高，13 批炙甘草共有37 个共有峰，表明13 批全国不同饮片企业市售炙甘草质量稳定、可控。

图3 13 批炙甘草指纹图谱匹配图

2.4.4 泻白散指纹图谱及特征峰指认

通过与对照药材比对，单味药炒桑白皮S10、地骨皮D10、炙甘草G11 与各对照品相似度较高、且外观性状较佳，故将单味药（S10、D10、G11）组合成泻白散样品X14。按照1.3.2 制备泻白散供试品溶液，在1.2 色谱条件下测定，一并对14 批泻白散组方（X1～X13）进行指纹图谱研究，结果见图4。

图4 14 批泻白散组方指纹图谱匹配图

将泻白散与桑辛素、甘草酸、异甘草素、桑皮苷A、地骨皮乙素、芹糖甘草苷、甘草素、异甘草苷、甘草苷、绿原酸、甘草酸铵、东莨菪内酯、大黄素13 种对照品进行比对，发现地骨皮乙素、绿原酸、甘草苷、芹糖甘草苷、异甘草苷、甘草酸、甘草酸铵7 种对照品在泻白散指纹图谱中有对应峰，匹配情况见表3。由表3 可知，甘草苷与芹糖甘草苷、甘草酸与甘草酸铵对应同一个色谱峰，推测原因可能是甘草苷与芹糖甘草苷极性相似导致此色谱条件下不能完全分离；甘草酸铵在酸性溶液中游离，实际上测定的都是甘草酸对应的色谱峰。通过对14 个泻白散组方的水煎液进行HPLC 指纹图谱分析，共有峰匹配情况见表4。由表4 可知，14 个泻白散组方的水煎液有9 个共有峰，其中可指认地骨皮乙素、异甘草苷、甘草酸3 个共有峰。

表3 泻白散与对照品匹配情况

表4 泻白散14 个组方共有峰匹配情况

3 结语

采用HPLC 指纹图谱方法对泻白散中3 种单味药饮片及泻白散进行了内在质量整体评价。所建立的HPLC 指纹图谱方法精密度、稳定性、重复性良好。所收集的样品遍布全国各大中药材市场及医院药店，代表性广，能够较真实的反应市售泻白散及三种单味药的内在质量情况，由研究结果可知市售桑白皮、地骨皮饮片质量参差不齐，质量不稳定，应该提升泻白散质量控制标准，保证经典名方泻白散临床疗效的发挥。