气相色谱法测定吴茱萸中3 种挥发性成分

张佳颖，尹艺，王哲，孙启航，李洪娟，赵娟娟

(滨州医学院药学院，山东烟台 264003)

吴茱萸为芸香科植物、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，气芳香浓郁，味辛辣而苦，具有清热止痛、降逆止呕的功效［1］，用于治疗肝胃虚寒、阴浊上逆所致的头痛或胃痛等症状［2-3］，并能治疗消化不良、湿疹、神经性皮炎及口腔溃疡等多种疾病，对心血管及免疫系统也具有一定的药效［4-7］。吴茱萸中含有挥发油、生物碱、柠檬苦素类、氨基酸类以及黄酮类等多种有效成分［8-11］。吴茱萸挥发性成分是其药效物质基础的一部分，具有抑菌杀菌、平喘、抑制麦角胺对α-受体的阻断等作用［12-13］，其中α-蒎烯对白色念珠菌具有明显的抑菌和杀菌作用［14］；柠檬烯具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化、抗菌抑菌、祛痰平喘、利胆溶石等多种功效［15］；罗勒烯不仅能提高植物对食草类昆虫及某些病原菌的抗性［16］，还对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。现有文献多是对吴茱萸挥发性成分进行分离鉴定［17-18］，而缺少对其中主要成分含量的测定研究，导致吴茱萸质量控制缺少保障。在吴茱萸挥发性成分分离鉴定的基础上，笔者建立气相色谱法对吴茱萸中罗勒烯、柠檬烯、α-蒎烯3 种挥发性成分进行含量测定，并通过聚类分析比较了4 个产地9 批吴茱萸药材样品中3 种挥发性成分的含量差异，为吴茱萸的全面质量控制提供科学依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：7890B 型，美国安捷伦科技有限公司。

集热式搅拌器：DF-101S 型，金坛市科析仪器有限公司。

调温加热套：DRT-TW 型，郑州科泰实验设备有限公司。

电子分析天平：TB-215D 型，感量为0.01 mg，丹佛仪器北京有限公司。

α-蒎烯、柠檬烯、罗勒烯对照品：纯度（质量分数）均大于95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

乙酸乙酯：色谱纯，批号为20160513，国药集团化学试剂有限公司。

无水硫酸钠：分析纯，批号为11528044，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

吴茱萸：收集于不同产地，如江西、陕西、贵州、浙江等。

实验用水为纯水。

1.2 溶液的制备

1.2.1 对照品溶液与混合标准工作溶液

分别称取α-蒎烯50 mg、柠檬烯1 500 mg 及罗勒烯250 mg，置于同一50 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，摇匀，得混合对照品储备溶液。分别移取不同体积的混合对照品储备溶液于一组10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯稀释至标线，摇匀，得到一系列不同质量浓度的混合标准工作溶液，于4℃条件下保存，待测。

1.2.2 供试品溶液

按照2020 版《中国药典》（4 部）中挥发油测定法（甲法）提取挥发油。称取吴茱萸50 g，置于2 000 mL 圆底烧瓶中，加入10 倍量水浸泡12 h，挥发油提取器蒸馏水上部精密加入3 mL 乙酸乙酯，加热保持微沸状态6 h，冷却至室温后，取乙酸乙酯层于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容，加入1 g 无水Na2SO4脱水，用微孔滤膜过滤，即得。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 挥发油成分鉴定

（1）色谱条件。色谱柱：DB-5 柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；升温程序：0～2 min 保持温度为60 ℃，2～29.5 min 以8℃／min 的速率升至280 ℃，保持5 min；进样口温度：260 ℃；分流比：10∶1；载气：氦气，流量为1.2 mL／min；进样体积：1 μL。

（2）质谱条件。离子源：EI 源；扫描时间：3.5 min；载气：甲烷，流量为1.0 mL／min；四级杆温度：280 ℃；离子源温度：300 ℃；质量范围：60～600 Da。

1.3.2 3 种挥发性成分含量测定

色谱柱：HP-5 弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；检测器：FID；升温程序：0～5 min，保持60 ℃，5～15 min，以4 ℃／min 的速率升至100 ℃；进样口温度：250 ℃；检测器温度：310 ℃；分流比：20∶1；载气：高纯氮气，流量为1 mL／min；尾吹气流量：45 mL／min；进样体积：1 μL。

2 结果与讨论

2.1 提取方法选择

挥发油的提取方法有水蒸气蒸馏法（SD）、索氏提取法（SE)、超临界流体萃取法（SFE)、微波辅助萃取法（MAE)等。水蒸气蒸馏法具有操作简单、装置简易、提取率高等优点，是一种提取挥发油的常用方法［19-21］。2020 版《中国药典》通则中收载了两种测定方法，甲法适用于测定相对密度小于1.0 的挥发油；乙法适用于测定相对密度大于1.0 的挥发油。吴茱萸挥发油相对密度在1.0 以下，因此选择水蒸气蒸馏法提取吴茱萸药材中的挥发油，为完善吴茱萸药材的质量标准提供参考。

2.2 挥发油成分鉴定

取适量供试品溶液，按照1.3.1 气相色谱-质谱（GC-MS）条件进样测定，通过NIST 标准谱库检索进一步确认化合物，吴茱萸挥发油共鉴定出33 种化合物，主要为萜类、烯醇类、酯类等物质，其中含量较高的物质为α-蒎烯、柠檬烯、罗勒烯、水芹醛、丁香酚、4-异丙基苯甲醇、石竹烯、芳樟醇、五烯酸。吴茱萸挥发油中化学成分GC-MS 法分析结果见表1所示。

表1 吴茱萸挥发油中化学成分GC-MS 分析结果

2.3 检测指标的选择

GC-MS 法鉴定结果表明，吴茱萸中的挥发性成分主要包括倍半萜烯类、醇类、酯类等物质，其中α-蒎烯和柠檬烯是较为常见的倍半萜化合物，罗勒烯是一种无环单萜类化合物，具有多种生理活性，如镇咳、祛痰、抗真菌、抑制肿瘤等［14-16］，因此测定吴茱萸中α-蒎烯、柠檬烯及罗勒烯3 种挥发性成分的含量对吴茱萸的质量控制有重要意义。

2.4 色谱图

分别取混合对照品溶液和供试品溶液，在1.3.2气相色谱条件下进样测定，典型色谱图见图1。由图1 可见，α-蒎烯、柠檬烯和罗勒烯与相邻色谱峰分离良好，拖尾因子在0.95～1.05 之间。

图1 对照品和吴茱萸样品的气相色谱图

2.5 线性关系和检出限

在1.3.2 气相色谱条件下，对系列标准混合工作溶液进行测定，记录α-蒎烯、柠檬烯及罗勒烯的色谱峰面积。以3 种挥发性成分的质量浓度为横坐标（x），以色谱峰面积为纵坐标（y）绘制标准工作曲线。按照3 倍信噪比计算方法的检出限，α-蒎烯、柠檬烯及罗勒烯的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。

表2 线性范围、线性方程、相关系数及检出限

由表2 可知，3 种挥发性成分在各自的质量浓度范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999，检出限为1.6～2.0 μg／mL，表明该方法灵敏度较高。

2.6 仪器精密度试验

取一种混合标准工作溶液，按照1.3.2 气相色谱条件重复进样6 次，测定结果见表3。由表3 可知，测定结果的相对标准偏差为1.0%～1.3%，表明该仪器的精密度良好。

表3 精密度试验结果

2.7 稳定性试验

取适量供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8 h时，分别在1.3.2 气相色谱条件下进行测定，试验结果见表4。由表4 可知，α-蒎烯、柠檬烯及罗勒烯色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为0.8%、0.8%和1.5%，表明供试品溶液在室温条件下8 h 内是稳定的。

表4 稳定性试验结果

2.8 重复性试验

取来源于浙江的吴茱萸样品6 份，按1.2.2 方法制备供试品溶液，在1.3.2 气相色谱条件下分别进样测定，试验结果见表5。由表5 可知，α-蒎烯、柠檬烯及罗勒烯峰面积的相对标准偏差分别为3.6%、1.7%、3.9%，表明该方法重复性良好。

表5 重复性试验结果

2.9 加标回收试验

选取已知含量的吴茱萸药材6 份，每份精密称定25 g，分别加入3 种对照品适量，按照1.2.2 方法分别制备含量约为100%的供试品溶液，在1.3.2 气相色谱条件下进行测定，计算回收率和方法精密度，试验结果见表6。

表6 加标回收试验结果

由表6 可知，3 种挥发性成分的样品加标回收率为92.6%～103.2%，测定结果的相对标准偏差小于5%。表明该方法具有较高的准确度和精密度，满足分析要求。

2.10 样品含量测定

分别精密称取50 g 不同产地的吴茱萸，按1.2.2制备供试品溶液，在1.3.2 气相色谱条件下测定，3种挥发性成分的测定结果见表7。由表7 可知，不同产地的吴茱萸中3 种挥发性成分含量差异较大，其中来自江西产地的吴茱萸中3 种挥发性成分的含量普遍偏高。

表7 不同产地吴茱萸中3 种挥发性成分测定结果 mg／g

2.11 聚类分析

采用SPSS 22.0 统计软件，对表7 中4 个产地的9 批吴茱萸所测成分进行聚类分析处理，用组间联结法，以Euclidean 距离作为吴茱萸样品的测度，9批吴茱萸挥发性成分的聚类分析树状图见图2。

图2 9 批吴茱萸挥发性成分的聚类分析树状图

由图2 可知，4 个不同产地的9 批吴茱萸药材可分为两类，其中S5 单独为一类，其余8 批吴茱萸药材聚为一类。分析发现S5 江西野生中花吴茱萸的挥发油含量远高于其余8 批吴茱萸药材 ，将S5的数据去除掉之后，剩余8 批吴茱萸挥发性成分聚类分析谱系图见图3。由图3 可知，8 批吴茱萸分为两大类，第一类：S1、S6、S7、S8 和S9；第二类：S2、S3 和S4。

图3 8 批吴茱萸挥发性成分的聚类分析树状图

采用所建的气相色谱法同时测定吴茱萸药材中α-蒎烯、柠檬烯及罗勒烯3 种挥发性成分的含量。结果显示，S5 吴茱萸中所测挥发性成分含量最高，为3.806 0%，S7 吴茱萸中所测挥发性成分含量最低，为0.067 5%，相差56 倍，其原因可能有植物遗传作用、产地的生长条件（海拔、水分、土壤、日照和地形等环境因素）、贮存环境等［22-24］。除去单独成类S5，其余8 批吴茱萸分为2 类，S2、S3、S4 聚为一类，这3 批药材均产自江西，且3 种挥发性成分的含量高于另一类，江西作为吴茱萸药材的道地产区，纬度28°左右，经度115°左右，海拔105 m 左右，环境适宜，生产的吴茱萸品质较高；S1、S6、S7、S8、S9聚为一类，分别产自陕西、贵州、浙江等地，结果表明产地的自然环境和种植条件对吴茱萸中挥发性成分有确切影响，因此在对吴茱萸药材进行质量控制时，有必要进行基源确证和挥发性成分的测定，以保证药材质量的均一性。

3 结语

采用气相色谱-质谱法鉴定出吴茱萸挥发油中的33 种化学成分，建立了同时测定吴茱萸中α-蒎烯、柠檬烯及罗勒烯3 种挥发性成分的气相色谱法，并应用所建方法测定了9 批不同来源的吴茱萸中α-蒎烯、柠檬烯及罗勒烯3 种成分的含量，表明不同来源和产地的吴茱萸药材中3 种挥发性成分含量差异较大。对4 个不同产地的9 批吴茱萸所测成分进行聚类分析处理，结果表明产地对吴茱萸中挥发性成分含量具有较大的相关性，对吴茱萸质量的均一性有影响。