连续流动分析法测定杏仁中氰化物

胡馨月，吴永强，赖晋锋，林莉，刘娅

（1.泸州市疾病预防控制中心，四川泸州 646000； 2.西南医科大学公共卫生学院，四川泸州 646000）

氰化物是含氰基的一类化合物的总称，是广泛存在于自然界的剧毒物质，可抑制组织细胞生物氧化酶活性，阻滞三羧酸循环，造成“细胞内窒息”。生活中氰化物中毒以口服为主(如误食含氰果仁）。GB 5009.36—2016 《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》中提及的定量检测方法主要有分光光度法及气相色谱法，但并未包含杏仁中的氰化物检测。在食品监测工作中，杏仁中氰化物的检测一般采用气相色谱法，但该方法精密度偏差过大且偏差方向难控，方法中因试剂等影响造成批次间电子俘获（ECD）响应重复性差。目前连续流动仪测定氰化物的方法广泛应用于职业卫生检测、环境检测及食品检测等众多领域［1-4］。韦小烨等［5］建立的鲜木薯中氰化物的流动注射测定法线性范围宽、重复性好，对于油脂含量较少的样品，可以直接水解提取，取上清液过滤后进行分析。然而，对于含有大量油脂的样品，如杏仁，如何在前处理过程中除去干扰，同时做到高回收率及高精密度等结果的测定方法尚未见报道。结合食品监测方法及部分研究成果［6-8］，研究人员建立了连续流动分析仪测定氰化物的方法，杏仁样品经前处理后，仪器密闭蒸馏出氢氰酸，与氯胺T 反应生成氯化氰，以异烟酸-巴比妥酸作染料，代替异烟酸-吡唑啉酮规避苯甲醛与吡唑啉酮反应产生白色混浊的干扰［9-10］，生成物于600 nm处比色定量［11-13］。笔者建立连续流动分析法测定杏仁中的氰化物，采用正己烷萃取除去油脂，滤膜过滤除去固体颗粒，拓展了杏仁中氰化物检测的方向。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

连续流动分析仪：SKALAR SAN5000 型，带有四针自动进样器及循环冷却水系统，荷兰SKALAR公司。

气相色谱仪：安捷伦7890A，带有CTC 顶空进样器及ECD 检测器，美国安捷伦科技公司。

超声清洗仪；KQ2200DB 型数控，昆山超声仪器有限公司。

电子分析天平：AL204-IC 型，感量为0.001 g，瑞士梅特勒-托利多公司。

低温冷冻离心机；SIGMA2-16K 型，德国希格玛公司。

氰化物标准溶液：50 mg／L，编号为GBW（E）080115，中国计量科学研究院。

水相针式滤器（聚醚砜）：13 mm×0.45 μm。

氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、氯胺T、1，3-二甲基巴比妥酸、异烟酸、正己烷：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

盐酸：分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

月桂醇聚氧乙烯醚（Brij35）：CAS 号为9002-92-0，荷兰SKALAR 公司。

实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

pH5.2 的缓冲溶液：称取氢氧化钠2.3 g 溶解于500 mL 超纯水中，加入20.5 g 邻苯二甲酸氢钾，加超纯水至975 mL 后，分别用1 mol／L 的盐酸和氢氧化钠溶液调节pH 至5.2，定容至1 L 后加入1 mL 月桂醇聚氧乙烯醚，充分溶解后过滤，于棕色瓶中冷藏，待用。

氯氨T 溶液：称取氯胺T 2.0 g，用超纯水定容至1 000 mL，过滤后使用。

显色剂：称取氢氧化钠7 g 于约500 mL 超纯水中，再加入1，3-二甲基巴比妥酸16.8 g、异烟酸13.6 g，加入970 mL 超纯水溶解，用1 mol／L 的盐酸和氢氧化钠溶液调节pH 至5.2。

氰化物系列标准工作溶液：吸取2 mL 氰化物标准溶液于50 mL 容量瓶中，用超纯水定容至标线，得2.0 mg／L 氰化物标准溶液，再分别吸取0、0.25、0.50、1.0、1.5、2.5、5.0、12.5 mL 上述2.0 mg／L氰化物标准溶液于比色管中，用超纯水定容至25.0 mL，配制成氰化物质量浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.12、0.20、0.40、1.00、2.00 mg／L 的系列标准工作溶液，现用现配。

1.3 样品前处理

低温下准确称取1.000 g（精确至0.001 g）已粉碎均匀的样品于样品管中，加入约40 mL 的超纯水，立即盖紧密封，超声提取3 次，每次提取10 min，每次提取间隔为1 h，以防止其内部液体温度过高产生膨胀，继而顶出密封盖，从而造成样品损失。于25～40 ℃放置48 h，使样品充分水解（应充分振摇，使样品无结块，振摇时应按住样品管盖，防止样品溢出），再把样品管放入冰箱于4 ℃冷藏2 h后，以10 000 r／min 冷冻离心10 min，取出上清液，在样品管中加入超纯水10 mL，振摇，冷冻离心，将取出的上清液合并后，加入10 mL 正己烷，充分振摇，静置分层后舍去正己烷，水层经过0.45 μm 的水系过滤膜过滤，滤液定容至100 mL，加入氢氧化钠0.2 g 使氢氧化钠质量浓度为2 g／L，冷藏，待混匀，待测。

1.4 加标样品制备

称取6 个均匀样品1.000 g（精确至0.001 g）于样品管中，分3 个批次加入50 mg／L 氰化物标准溶液0.2、0.7、1.0 mL，同1.3 方法进行处理，分别得到质量浓度为0.1、0.35、0.5 mg／L 的加标样品。

1.5 仪器工作条件

进样时间：80 s；冲洗时间：90 s；探测峰起始值：0.01 AbS；峰形宽度：30%（5%～100%）；加热器温度：155、40 ℃；检测波长：600 nm。

2 结果与讨论

2.1 氢氧化钠加入时机的优化

氢氧化钠的加入时机，分为在提取初和提取后加入。在提取初加入氢氧化钠可以更好的保留样品中氰化物的含量，但实际操作中，在提取初加入氢氧化钠易致使样品“胶质化”严重，溶液不易经0.45 μm 的水系过滤膜过滤，故选择在低温提取后加入氢氧化钠调节pH。

2.2 萃取剂及其用量的选择

2.2.1 萃取剂

对于油脂含量较低的样品，可直接经0.45 μm的水系过滤膜过滤测定，但杏仁中油脂含量高达50.33%［14］，易造成滤膜堵塞，不宜过滤。在了解杏仁中脂肪及蛋白质的含量及特性［15］后，选择易过滤样品，经正己烷处理后测定，结果数据见表1。由表1 可知，样品加标回收率为98.0%～104.7%，符合测定要求，正己烷对于测定结果并未产生偏差影响，因此选用正己烷为萃取剂。

表1 加入正己烷后样品测定结果

2.2.2 正己烷用量

分别采用5、10、20 mL 正己烷完成萃取过程，所得试验结果见表2。由表2 可知，样品加标回收率为98.3%～97.3%，符合测定要求。经t检验，在此样本量下，分别加入5、10、20 mL 正己烷后，结果差异均无统计学意义（P＞0.05），但在实际操作中，为保证油脂量高样品的萃取效率，推荐加入10 mL 正己烷进行萃取。

表2 加入不同体积正己烷后样品测定结果

2.3 样品放置时间及温度选择

参照食品风险监测中气相色谱法的前处理条件，为了使样品能够水解地更加充分，将样品于25～40 ℃条件下放置48 h 密封水解，样品充分水解后，放至冰箱冷藏2 h 再离心，可使样品更好地脂水分离，且提高了正己烷的萃取效果，因此样品水解温度为25～40 ℃，放置时间为48 h。

2.4 线性方程与检出限

2.4.1 线性方程

在1.5 仪器工作条件下测定氰化物系列标准工作溶液，以氰化物质量浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标绘制标准工作曲线，若取0～2.00 mg／L浓度区间，线性方程为y=0.000 64x+0.002 36，相关系数（r）为0.999 4；若取0～1.00 mg／L 浓度区间，线性方程为y=0.000 66x-0.000 55，相关系数（r）为0.999 9。比较发现，浓度过高易造成峰与峰之间的距离过小，峰面积叠加掩盖，导致曲线r值降低，因此连续流动分析法测定氰化物标准工作曲线的线性范围为0～1.0 mg／L，超出范围的样品需稀释后进行测定。

2.4.2 检出限

采用连续流动分析法测定空白样品11 次，若杏仁取样为1.000 g，定容100 mL 时，用2.764 倍标准差计算检出限，检出限为0.05 mg／kg，定量限为0.15 mg／kg。

2.5 回收率与精密度

在已知含量的样品溶液中加入1.4 中低、中、高浓度的加标样品溶液，在1.5 仪器工作条件下重复测定6 次，试验结果见表3。由表3 可知，平均回收率为98.0%～104.7%，测定结果的相对标准偏差为0.56%～1.34%，表明该方法具有较高的准确度和精密度，满足检测要求。

表3 加标回收率和精密度试验结果

2.6 比对试验

连续流动分析方法与气相色谱法从以下几个方面进行比对：

（1）开机稳定时间、样品用量及稳定性。连续流动分析仪开机到稳定耗时较短，从进样蒸馏到测定仅需约0.5 h，全程密闭蒸馏加试剂，连续进样后，每个样品分析时间约为2 min，每次进样为2 mL，在分析过程中序列可以连续加入后续样品。气相色谱仪稳定耗时较连续流动分析仪长，每个样品分析时间约为10 min，每次进样为10 mL，且在现阶段技术条件下，样品序列编辑运行后不能随时加入后续样品，需重新编辑序列及测定标准。样品量少时，二者耗时区别不大，随着样品量增加，连续流动法测定耗时明显较气相色谱法短。连续流动法在样品提取后加入了氢氧化钠以保留氰基，使样品中被测物质在水中稳定性增加，因此从耗时耗量及样品稳定性上看，连续流动法优于气相色谱法。

（2）线性范围。连续流动法测定过程中氰化物浓度过高易造成峰过大，峰间距过小，峰面积叠加掩盖，从而导致测定值准确度低，因此连续流动分析法测定氰化物的质量浓度应在0～1.0 mg／L 范围内，超出线性范围的样品需稀释后测定。气相色谱法的线性范围超过1.0 mg／L 后，相关系数降低，在0～1.0 mg／L 质量浓度范围内，连续流动法的r值为0.999 9，优于气相色谱法r值（0.998 6），因此在此浓度范围内连续流动法优于气相色谱法。

（3）检出限。气相色谱ECD 检测器对氰基响应灵敏度高，检出限较连续流动法低。虽气相色谱法检出限优于连续流动法，但两法检出限均能满足检测要求。

（4）回收率。两种方法的回收率均能满足检测要求，但气相色谱法回收率跨度远大于连续流动分析法，且方法的不可控因素更多(如氯胺T)，因此，在0～1.0 mg／L 质量浓度范围内连续流动法回收率要优于气相色谱法。

（5）精密度。在0～1.0 mg／L 浓度范围内，对两种方法的检测结果进行用F检验，低、中、高浓度组的F值均大于F值表中F(5，5)=5.05，即连续流动分析法的精密度优于气相色谱法。

连续流动分析法与气相色谱法比对结果如表4所示。

表4 比对试验结果

3 结语

建立了连续流动分析法测定杏仁中的氰化物。样品超声过程应密封且时间不能连续过长，以防止样品过热造成喷溅；样品水解后离心冷藏（4～8 ℃）时间应在30 min 以上，利于油脂分离；样品经正己烷萃取，并在滤液中加入氢氧化钠，以增加氰化物在水溶液中的稳定性；试剂在测定过程中均在较密闭空间内。连续流动分析的精密度、加标回收率等较气相色谱法的误差小，虽检出限较气相色谱法略高，但在实际工作中能满足检测要求，因此连续流动仪测定杏仁中氰化物的方法整体优于气相色谱法，其在线分析时间更短，稳定性及安全性更好，适于推广应用。