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酸枣仁百合睡眠肽复合物改善失眠模型大鼠的睡眠

2021-10-09梁曹雯曹庸李俊刘果朱晓艾冯孔龙陈媛媛李赟罗珍

现代食品科技 2021年9期
关键词:旷场酸枣仁神经递质

梁曹雯,曹庸*,李俊,刘果,朱晓艾,冯孔龙,陈媛媛,李赟,罗珍

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642)(2.无限极(中国)有限公司,广东广州 510665)

多个研究已经证明牛乳中含有能促进睡眠的肽[1,2]。2009 年Saint-Hilaire[3]研究的结果证明牛乳源促睡眠肽对人睡眠也有促进作用,长期施用牛乳源络蛋白水解肽在4 周期间对睡眠的各个方面具有显著影响,用牛乳源酪蛋白水解肽治疗的受试者在治疗14 d后显示出PSQI-J(匹茨堡睡眠质量指数量表)总得分显著降低,治疗28 d 后这种改善作用更大,并且在治疗停止一周后仍然可以察觉。2016 年Dela[4]研究表明牛乳磷酸酪蛋白水解肽具有促进睡眠的特性,增强戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠。它还能促进慢波(δ)脑电图大鼠活动;指示睡眠或放松的模式。通过实验证明其促进睡眠的作用可能是通过介导的GABAA(γ-氨基丁酸A 型)受体-氯离子通道产生效果。有研究表明α酪蛋白能减轻猫的焦虑症状[5]。

DL-4-氯苯基丙氨酸(PCPA)是色氨酸羟化酶(TDH)的抑制剂,TDH 是5-HT(五羟色胺)合成的限速酶,PCPA 致失眠大鼠模型复制成功后失眠大鼠脑内神经递质5-HT 显著下降从而导致大鼠昼夜节律消失,导致大鼠失眠。酸枣仁与百合是两种具有镇静催眠作用的药食同源食材,常与其他有助眠作用的植物复配使用[7]。研究证实酸枣仁提取物能减少小鼠自主活动次数,对中枢神经有抑制作用[8],可提高小鼠神经中枢神经递质5-HT 含量,更有研究认为酸枣仁提取物作用于GABA 系统[7];有研究表明百合提取物对5-HT 通路起作用,对戊巴比妥钠诱导的睡眠时间有延长作用[9,10]。

本实验室在前期研究中已经通过电生理膜片钳技术对牛乳酪蛋白酶解物进行活性鉴定,判定牛乳睡眠肽抑制大鼠下丘脑VLPO区(视前腹外侧核)神经细胞自发放电的体外活性;将分离出的牛乳促睡眠肽通过协同戊巴比妥钠实验判定了牛乳促睡眠肽有协同戊巴比妥钠促睡眠的效果,验证了牛乳促睡眠肽大鼠体内的促睡眠活性[4-6]。

本研究通过复制PCPA 致大鼠失眠模型探究复合物对失眠大鼠睡眠的改善作用。复合物由牛乳促睡眠肽、酸枣仁提取物、百合提取物按照一定比例复配而成。经旷场实验探究复合物对失眠大鼠行为学影响,探讨复合物对失眠大鼠睡眠的改善作用;通过检测下丘脑中神经递质及其代谢产物变化探究复合物对失眠大鼠睡眠的调控机制。为牛乳促睡眠肽的助眠效果、抑制焦虑作用提供依据;同时将古方酸枣仁、百合这两种药食同源物与促睡眠肽结合,通过多个神经递质通路联合改善失眠大鼠睡眠。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

1.1.1 实验材料

原料:酶解牛乳多肽由广州绿萃生物科技有限公司提供。

实验动物:32 只体重约为150~200 g 健康的雄性成年SPF 级SD 大鼠,购自南方医科大学,实验动物生产许可证号:SCXK(粤)2016-0041。基础饲料适应性喂养7 d 后,按体重平均随机分成4 组(n=8)。试验期间,每天早上9:00 观察动物皮毛色泽、行为活动等情况,每天测量体重、摄食量各1 次。实验期间,各组动物单笼饲养,室内温度22±2℃,湿度50%± 10%,饲养环境实行12 h 光照、12 h 黑暗自动控制,期间动物自由摄食饮水。

主要试剂:乙腈(质谱级)、甲醇(质谱级)、甲酸(质谱级),美国Fisher 公司;γ-氨基丁酸(GABA)标准品、5-羟色胺酸(5-HT)标准品、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)标准品、L-去甲肾上腺素(NE)标准品、多巴胺盐酸盐(DA)标准品、二羟苯乙酸(DOPAC)标准品,源叶生物;对氯苯丙氨酸(PCPA)标准品,美国Sigma 公司。

1.1.2 主要仪器设备

AB SCIEX 4500 三重四极杆质谱仪,美国SCIEX公司;LC-30A 液相色谱,日本岛津公司;SMART v3.0.05 动物行为学视频采集与分析系统,美国Panlab Harvard Apparatus 公司;Centrifuge 5415R 高速冷冻离心机,德国Eppendorf 公司;XW-80A 漩涡混合器,上海精科实业有限公司,DW-86L388 立式超低温保存箱;青岛海尔特种电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 低温连续相变萃取促睡眠活性物

低温连续相变萃取酸枣仁促睡眠活性物:将酸枣仁清理除杂后粉碎,把粉碎过20 目筛后的酸枣仁装进连续相变萃取装置的50 L 萃取釜中。参考前期研究的结果,在原料堆密度0.39 kg/L、萃取温度70℃、萃取压力0.7 MPa、75 L/h 流速、萃取时间3 h 的条件下进行低温连续相变用70%乙醇萃取一次;萃取温度70℃、萃取压力0.2 MPa、75 L/h 流速、萃取时间3 h的条件下用三级水进行低温连续相变萃取第二次[9,10]。

将提取液在60℃条件下减压浓缩至固形物含量为30%,利用喷雾干燥技术干燥浓缩液得到酸枣仁提取物。喷雾干燥参数:进风温度150℃,出风温度90℃,转速12000 r/min,进料速度3 L/h。

低温连续相变萃取百合促睡眠活性物:将百合清理除杂后粉碎,将粉过10 目筛。因百合原料较硬,提取前需先用70%乙醇浸泡12 h 至原料变软后再提取。将百合原料及浸泡液装进连续相变萃取装置的50 L萃取釜中,参考前期研究结果,在原料堆密度0.40 kg/L、萃取温度70℃、萃取压力0.2 MPa、75 L/h 流速、萃取时间3 h 的条件下进行低温连续相变用70%乙醇萃取一次;萃取温度70℃、萃取压力0.2 MPa、100 L/h 流速、萃取时间3 h 的条件下用三级水进行低温连续相变萃取第二次[10]。

将提取液在60℃条件下减压浓缩至固形物含量为30%,利用喷雾干燥技术干燥浓缩液得到百合提取物。喷雾干燥参数:进风温度150℃,出风温度90℃,转速12000 r/min,进料速度3 L/h。

1.2.2 构建PCPA 致大鼠失眠模型

大鼠适应7 d 后除正常对照组外,其余各组大鼠每日上午8:00~8:30 腹腔注射PCPA 300 mg/kg,灌胃量为10 mL/kg,每日灌胃1 次,连续注射2 d,正常对照组腹腔注射与PCPA同体积的弱碱性0.9%氯化钠注射液。

1.2.3 给药方法

大鼠失眠模型复制成功后,给药组每天上午8:00给予样品灌胃,将酸枣仁提取物、百合提取物、睡眠肽(2:2:1)复配成复合物给药剂量为600 mg/kg·d;地西泮对照组给药剂量为3 mg/kg·d。连续给药7 d,最后一次(给药第7 d)给药前禁食12 h。最后一次给药后观察自主活动,于灌胃后60 min 用10%水合氯醛0.3 g/kg 剂量进行腹腔注射后取大鼠脑用以检测。

1.2.4 大鼠行为学实验

本研究用旷场实验来评价大鼠在新环境中的焦虑度、自主及探究行为。通过以大鼠在旷场中某些行为发生的次数以及持续的时间来反应检测指标。旷场反应箱高50 cm,底边长50 cm,将旷场内部区域设为4×4的方格,中间4 格联合为中央区域,外周方格联合为周边区域。将旷场摆放在白炽灯正下方,调整相机位置于旷场正上方。旷场实验于安静的环境下进行。实验人员将动物由统一角度放入箱内底面中心后进行摄像和计时。通过摄像头自发记录大鼠活动情况。每只大鼠测试10 min,测试后清洁旷场擦拭、清洗方箱内壁及底面防止留下气味及排泄物等。

测试指标包括:大鼠旷场运动总路程、大鼠旷场中央停留次数、中央停留时间等[11-15]。

1.2.5 超高效液相色谱-串联质谱法测定神经递质

动物样品前处理:在低温手术台上取大鼠下丘脑部位,置于5 mL 离心管中按每20 mg 脑400 μL 组织裂解液的比例加入组织裂解液,于冷冻珠磨机内匀浆,放于-20℃冰箱中孵育20 min,冷冻离心20 min(13200 r/min,4℃),用0.22 μm 滤膜过滤,供分析。

试剂配制:脑组织裂解液:甲醇:乙腈:甲酸为1:9:0.02。

色谱条件:色谱柱为上海月旭welch ultimate C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相:0.1%甲酸水(A)和乙腈(B)。

梯度洗脱程序:流速0.5 mL/min,柱温30℃,进样量20 μL。2% B 0.1~2.5 min;2% B~30% B 2.5~8 min。

质谱条件[16-21]气帘气(CUR)压力:40.0 psi;碰撞气体:N2;喷雾电压:5500 V;离子源温度:500℃;GS1:50 psi,GS2:50 psi;气体流速:12 L/min。

1.3 统计学处理

使用SPSS 21.0 软件处理数据,数据用平均值±方差()表示,p<0.05 则有统计学意义,说明有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 复合物对PCPA 致失眠大鼠行为学的影响

2.1.1 复合物对大鼠运动轨迹的影响

图1、图2 为空白组大鼠、失眠模型组大鼠、复合物与阳性对照组的大鼠2D 及3D 运动轨迹图,由图1 可知,失眠模型组大鼠较空白组大鼠在旷场中的运动更频繁,运动轨迹更密集,说明失眠大鼠在旷场焦虑感上升。失眠大鼠在经过复合物及阳性药物干预之后,运动轨迹相对失眠模型组稀疏,说明其在旷场中的焦虑感明显减少。

图1 大鼠运动轨迹2D 图 Fig.1 Plan of rat trajectory

图2 大鼠运动轨迹3D 图 Fig.2 3D map of rat trajectory

2.1.2 复合物对PCPA 致失眠大鼠旷场指标的影响

由表1,失眠模型组大鼠在中央停留次数、中央区停留时间、运动总路程分别为18.67、37.88 s、5013.24 cm,与空白组有显著差异(p<0.05),失眠模型组大鼠总静止时间222.68 s 与空白组的145.05 s 无显著差异(p>0.05),以上指标在一定的程度上反映了失眠模型大鼠在旷场中比较紧张、活动增加。复合物组大鼠在中央停留次数、中央区停留时间、运动总路程分别为11.00、15.01 s、3309.71 cm,与失眠模型组相比有显著差异(p<0.05),与空白组相比无显著差异(p>0.05)。阳性药物组与失眠模型组大鼠在旷场中央停留次数有显著差异(p<0.05),该结果提示,复合物能改善失眠大鼠在旷场中央停留次数、中央区停留时间、运动总路程,复合物与阳性药物均能改善大鼠因失眠导致的在旷场中的焦虑状况。

表1 复合物对PCPA 致失眠大鼠旷场运动影响 Table 1 Effect of compound on open field exercise of insomnia rats

2.2 复合物对PCPA 致失眠大鼠下丘脑中神经递质的影响

2.2.1 复合物对PCPA 致失眠大鼠下丘脑中神经递质的影响

PCPA 是色氨酸羟化酶(TDH)的抑制剂,通过阻断5-HT 合成,导致大鼠脑内5-HT 含量降低,从而昼夜节律消失。由表2 结果可知,与空白组相比失眠模型组大鼠下丘脑中5-HT 含量显著降低(p<0.05)提示PCPA 致大鼠失眠模型复制成功。失眠模型组大鼠与复合物组大鼠5-HT 无显著差异(p>0.05),空白组与复合物组5-HT 无显著差异(p>0.05)。

表2 复合物对PCPA 致失眠大鼠下丘脑中神经递质的影响 Table 2 Effect of compound on neurotransmitters in hypothalamus of insomnia rats

失眠大鼠GABA、Glu、Gly、NE、DA、5-HT 含量为78.54 μg/mL、1514.56 μg/L、68.95 μg/L、53.94 μg/L、2.18 μg/L、1.42 μg/L;失眠模型组神经递质GABA 含量显著下降(p<0.05)、DA 的含量均显著上升(p<0.05),Glu、Gly 无显著变化(p>0.05),兴奋性神经递质NE 显著上升(p<0.05)。给予灌胃给样一周后,复合物组GABA、Glu、Gly、NE、DA、5-HT含量为94.96 μg/mL、1508.42 μg/L、74.59 μg/L、37.36 μg/L、1.76 μg/L、1.61 μg/L。复合物组与阳性对照组,与失眠模型组相比大鼠下丘脑抑制性神经递质GABA含量显著上升(p<0.05),兴奋性神经递质NE、DA含量显著下降(p<0.05);表明复合物组可通过调节大鼠下丘脑中的神经递质,从而达到镇静催眠的效果。

2.2.2 复合物对PCPA 致失眠大鼠下丘脑中神经递质及其代谢产物的影响

2.2.2.1 复合物对PCPA致失眠大鼠下丘脑中5-HT 及其代谢产物5-HIAA 的影响

由表3 结果可知,失眠模型组大鼠下丘脑中5-HIAA 含量14.13 μg/L,与空白组相比显著降低(p<0.05);与复合物组大鼠无显著差异(p>0.05),空白组5-HIAA 含量28.69 μg/L,与复合物组、牛乳睡眠肽组、阳性药物组相比,5-HIAA 含量显著降低,有显著差异(p<0.05)。

由表3 空白组5-HIAA/5-HT 为13.06,与其他各组5-HIAA/5-HT 都有显著差异(p<0.05);复合物组5-HIAA、5-HT 含量分别为11.85 μg/L、1.42 μg/L,5-HT与空白组无显著差异(p>0.05);5-HIAA 与空白组相比显著下降(p<0.05)。说明复合物影响了5-HT 及其代谢产物从而改善睡眠。

表3 复合物对PCPA 致失眠大鼠下丘脑中5-HT、5-HIAA 的影响 Table 3 Effect of complex on 5-HT and 5-HIAA in hypothalamus of insomnia rats

2.2.2.2 复合物对PCPA 致失眠大鼠下丘脑中GABA及其代谢产物的影响

表4 复合物对PCPA 致失眠大鼠下丘脑中GABA、Glu 的影响 Table 4 Effects of compound on GABA and Glu in hypothalamus of insomnia rats

Glu 脱羧后的代谢产物为GABA,GABA 被认为在中枢神经系统中是一种重要的抑制性递质;而Glu则是一种兴奋性神经递质。大鼠被剥夺睡眠后,失眠模型组GABA、Glu 含量分别为78.54 μg/mL、1514.56 μg/L。Glu 在失眠模型组与空白组中相差无显著性(p>0.05),GABA 在失眠模型组与空白组中有显著性(p<0.05),给予阳性药物及复合物后GABA 含量在各样品组中均上升。复合物组GABA、Glu 含量分别为94.96 μg/mL、1508.42 μg/L;阳性药物组GABA、Glu含量、Glu/GABA 值分别为101.75 μg/mL、1448.69 μg/L、1.45,复合物组Glu/GABA 比值在与模型组、空白组比值无显著差异(p>0.05)。阳性对照组Glu/GABA值相比失眠模型组有显著变化(p<0.05),说明阳性药物对GABA 及其代谢速率有影响,复合物能影响大鼠下丘脑内GABA,但对其代谢无显著影响。

2.2.2.3 复合物对PCPA 致失眠大鼠下丘脑中DA 及其代谢产物DOPAC 的影响

DA 的代谢产物为DOPAC。由表5 可知,失眠模型组DA、DOPAC、DAPOC/DA 分别为2.18 μg/L、66.96 μg/L、31.79;与空白组相比,失眠模型组大鼠下丘脑中DOPAC 含量降低,不具有显著性差异(p>0.05)。复合物组DA、DOPAC、DAPOC/DA 分别为1.76 μg/L、75.71 μg/L、41.78;空白组与复合物组相比,下丘脑中DOPAC 含量无显著差异(p>0.05)。阳性药物组DOPAC 含量相对于空白组降低(p<0.05)。提示复合物能降低DA 含量,但对其代谢速率无显著影响(p>0.05)。

表5 复合物对PCPA 致失眠大鼠下丘脑中DA、DOPAC 的影响 Table 5 Effect of compound on DA and DOPAC in hypothalamus of insomnia rats

3 结论

3.1 动物的行为学及脑内神经递质含量在一定程度上反映了其生理状况,这也是改善失眠实验研究的主要入手方向,通过腹腔注射PCPA 复制失眠模型,腹腔注射PCPA 48 h 后,大鼠开始暴躁不安、体重减轻、白天也活动不停且具有攻击性由此判定模型复制成功[22]。

3.2 在酸枣仁百合睡眠肽复合物的干预下,失眠大鼠在旷场中的中央停留次数、中央区停留时间、运动总路程降低,差异具有统计学意义(p<0.05),说明复合物可以减轻失眠大鼠在旷场中的焦虑感。在复合物干预大鼠下丘脑中5-HT 分别升高,兴奋性神经递质DA、NE,抑制性神经递质GABA 含量升高(p<0.05),DA、GABA 代谢速率无显著变化(p>0.05),5-HT 代谢产物5-HIAA 代谢途径速率加快(p<0.05),说明复合方能通过影响大鼠下丘脑中神经递质改善失眠大鼠的睡眠及焦虑。酸枣仁与百合为传统治疗失眠的药食同源物质,其有效促眠活性物质为酸枣仁皂苷、百合皂苷等物质,且其助眠机制与主要助眠活性成份为近期研究热点。本研究将酸枣仁、百合促睡眠活性物与睡眠肽复配成复合物。结果表明酸枣仁百合复合物能改善失眠大鼠行为学与神经递质,复合物对下丘脑神经递质的调节作用可能是其改善睡眠的作用机制。综上所述,复合物能有效改善失眠大鼠睡眠并为促睡眠肽改善睡眠提供了理论依据。

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