北冬虫夏草角鲨烯单氧酶基因的类胡萝卜素生物合成功能解析

赵逸，陈海盈，李舒丽，许玮竣，郭丽琼,2，林俊芳,2，叶志伟,2*

（1.华南农业大学食品学院,食品生物技术研究所,广东广州 510642）（2.广东省微生态制剂工程技术研究中心,广东广州 510642）

北冬虫夏草（Cordyceps militaris）是具有珍贵食药两用价值的子囊菌[1]，作为冬虫夏草的人工栽培替代品，2009 年被我国卫生部批准为新资源食品[2]。药理研究表明，北冬虫夏草含有抗衰老、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等生物活性的多种化学成分[3,4]，如类胡萝卜素、核苷类化合物、虫草多糖、多种矿物质等[5]。类胡萝卜素是由异戊二烯单元组成的含脂肪族多烯链的萜类化合物，其中异戊二烯单元的数目和化学修饰决定了结构多样性[6,7]。研究表明，光照通过影响新陈代谢进程而调节北冬虫夏草类胡萝卜素的生物合成[8]。此外，微生物在盐、高温等非生物因素胁迫下会选择性地合成类胡萝卜素等萜类物质以抵御不利的环境条件[9,10]。北冬虫夏草含有多种类胡萝卜素[11-13]，但其生物合成途径尚未被阐明，八氢番茄红素脱氢酶（PDS）和ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）等类胡萝卜素合成功能酶亦未在北冬虫夏草中发现。因此，探究北冬虫夏草类胡萝卜素合成相关基因在解析其新型类胡萝卜素合成通路上具有重要的研究意义。

角鲨烯单氧酶（squalene monooxygenase），又称为角鲨烯环氧酶（squalene epxidase），是萜类化合物合成的关键限速酶[14,15]。Furubayashi 等[16,17]推测C30类胡萝卜素合成过程中存在“角鲨烯路线”，即催化法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，FPP）生成脱氢角鲨烯用于合成类胡萝卜素色素。项目组前期研究（北冬虫夏草CM10 菌株接种在PDA 培养基作为对照组，分别在培养基中添加KMnO4、NaCl 胁迫因子作为实验组进行转录组测序）表明，在KMnO4和NaCl 等因子胁迫下北冬虫夏草类胡萝卜素累积量和角鲨烯单氧酶基因erg1的转录水平均有上升，推测北冬虫夏草通过萜类化合物的形成以抵御环境胁迫因子引起活性氧积累而造成生物膜氧化、核酸和蛋白质变性等应激损伤[18]。

为了进一步分析erg1基因与北冬虫夏草萜类化合物类胡萝卜素合成的关系，本研究通过构建erg1基因的过表达载体，用根瘤农杆菌侵染的方式将核酸片段插入到北冬虫夏草基因组中，然后通过3 轮传代筛选erg1基因过表达稳定遗传菌株[19]，测定类胡萝卜素生物合成量并进行erg1基因的功能验证，为北冬虫夏草萜类化合物生物合成机制及功能基因的分析研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

北冬虫夏草（Cordyceps militaris）CM10 菌株购于山东省宁阳县海鑫生物科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL-1 购于上海唯地生物生物技术有限公司；质粒pCambia0390-blpR-Pcmgpd 为所在研究组实验室保存。

1.1.2 主要实验仪器

5804R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；FRESCO21 微量台式冷冻离心机，Thermo Fisher Scientific 公司；CFX96 Real-Time PCR Detection System、MJ Mini PCR、GelDoCTMXR＋凝胶快速成像系统，BIO-RAD 公司。

1.1.3 引物

本文所用引物如表1 所示。

表1 基因扩增的引物序列 Table 1 Primer sequences for gene amplification

1.2 实验方法

1.2.1erg1基因全长克隆

北冬虫夏草基因组DNA 按照Omega 真菌基因组DNA 提取试剂盒（Omega）说明书进行提取。根据北冬虫夏草erg1基因（GenBank：NW_006271973.1）的上下游序列，设计引物erg1-1F/1R 并对目的基因进行扩增。以PCR 产物为模板，利用引物erg1-2F/2R，在erg1片段上游下游分别引入限制性酶切位点和同源臂序列。阴性对照以超纯水作为模板进行PCR 扩增。反应体系（50 μL）：模板1 μL（<200 ng），上下游引物各1.5 μL（0.3 μM），KOD FX 1 μL（1 U），dNTPs 10 μL（0.4 mM），2×PCR buffer 25 μL，加超纯水至50 μL。PCR 条件为：94℃ 2 min ，98℃ 10 s ，54℃ 30s，68℃ 2 min，30 个循环；4℃保存。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带并使用琼脂糖凝胶DNA 纯化回收试剂盒（MAGEN）回收目的片段和进行测序比对。

1.2.2erg1基因过表达载体的构建

利用Bsp1407 Ⅰ和BcuⅠ对纯化的目的片段和pCambia0390-blpR-Pcmgpd 质粒进行双酶切处理并纯化回收。利用Seamless Assembly Cloning Kit（Taihe）将线性化的pCambia0390-blpR-Pcmgpd 质粒和目的基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并于含卡那霉素的LB（10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g 氯化钠，1 L 超纯水，pH 7.0）平板中37℃培养过夜。挑选拟转化子并扩大培养，提取质粒进行测序鉴定，将正确的重组质粒命名为 pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1（图1）。

图1 重组载体pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1 质粒图谱 Fig.1 The plasmid profile of recombinant vector pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1

1.2.3 质粒电转化根瘤农杆菌

将重组质粒与100 μL 根瘤农杆菌AGL-1 菌株感受态细胞在冰浴中混合，转移至冷冻电击杯中并置于电转仪。在电压1.8 kV，1 pulse 条件下进行电击处理，结束后加入1 mL LB 培养基，30℃震荡培养2～3 h 并涂布于含有卡那霉素和羧苄青霉素的LB 平板，30℃培养2～3 d 至菌落形成。

1.2.4 根瘤农杆菌侵染北冬虫夏草孢子

将北冬虫夏草菌株接种到PPDA（200 g 马铃薯，20 g 葡萄糖，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4·7H2O，10 g蛋白胨，15 g 琼脂，10 mg 维生素B1，加超纯水至1 L）平板，25℃暗培养14～21 d，光照5～7 d。用0.05%吐温80 溶液润洗平板表面菌丝，收集孢子，使孢子浓度为每毫升104～106个/mL，于无菌离心管中备用。

挑取携带重组质粒的根瘤农杆菌转化子单菌落扩大培养后接种到含乙酰丁香酮的IM 培养基（1.45 g KH2PO4、2.05 g K2HPO4、0.15 g NaCl、0.5 g MgSO4·7H2O、66 mg CaCl2·2H2O、2.48 mg FeSO4·7H2O、0.5 g (NH4)2SO4、1.8 g 葡萄糖、5 mL甘油，用超纯水定容至1 L，pH 5.5）中，起始浓度OD600为0.15，震荡培养12 h 左右至OD600为0.8。与北冬虫夏草孢子悬浮液按照一定比例混合均匀，涂布在贴有玻璃纸的IMA 培养基平板（含乙酰丁香酮），25℃黑暗培养2～3 d。待玻璃纸有白点冒出时，将玻璃纸转移至PDA 培养基（含有羧苄青霉素和Basta）上，25℃黑暗培养5～7 d 至转化子出现。

挑取拟转化子至PDA 培养基，待菌落长至直径为2 cm 提取基因组并用引物check-F/check-R 进行PCR 验证，将正确的北冬虫夏草转化子命名为Cmerg1。

1.2.5 实时荧光定量PCR 检测基因表达水平

取北冬虫夏草菌丝球在液氮中充分研磨，利用真菌RNA 提取试剂盒（Omega）提取总RNA。使用TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisiSuperMix 反转录合成cDNA 。采用SYBRGreen II 嵌合荧光法，以cDNA 为qRT-PCR 的模板、tef1为内参基因[20]，检测erg1基因在空白组、胁迫因子KMnO4组、胁迫因子NaCl 组中的表达差异水平。反应程序：94℃ 30 s ，94℃ 5 s，55℃ 15 s ，72℃ 10 s ，40 个循环。用Excel 统计内参基因与目的基因erg1的Ct 值，计算2-△△Ct显示表达水平[21]。

1.2.6 类胡萝卜素的测定

接种CM10 菌株、Cmerg1 菌株于PDA 液体培养基，25℃、150 r/min 黑暗培养6 d，后分别加入胁迫因子高锰酸钾（0.4 g/L）和氯化钠（2 g/L）再光照培养5 d。菌丝体进行冷冻干燥后，用酸加热法测定菌丝体的类胡萝卜素含量[22]。

1.2.7 数据处理

每个样品设置 3 个平行，实验数据采用“mean±SD”表示。应用GraphPad Prism 8 软件进行数据分析和柱形图的绘制，当p<0.05 时显著性差异。

2 结果与分析

2.1erg1基因克隆及纯化

以北冬虫夏草CM10 菌株基因组DNA 为模板，erg1-1F/1R 为引物进行扩增，再以erg1-2F/2R 为引物进行二次PCR 得到erg1上下游同源臂。将PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，发现在2000 bp 处都有明显的单一条带，与预计大小一致（图2）。目的基因的测序结果表明，erg1上下游同源臂已经成功克隆。

图2 erg1 的PCR 扩增 Fig.2 PCR amplification for erg1 gene

2.2 重组载体pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1的构建及转化

对pCambia0390-blpR-Pcmgpd 质粒进行双酶切处理，切胶回收9410 bp 的线性载体（图3a）。将目的基因erg1上下游同源臂与线性载体连接后转化至大肠杆菌DH5α，接着进行菌液PCR 鉴定及质粒Bsp1407Ⅰ和BcuⅠ双酶切鉴定。对重组载体进行提取（图 3b），测序分析进一步验证重组载体pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1 被成功构建。利用电转化方式将载体转至根瘤农杆菌AGL-1 内，菌液PCR鉴定拟转化子，结果表明根瘤农杆菌AGL_pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1 被成功构建。

图3 质粒的酶切与重组质粒的鉴定 Fig.3 Enzymatic digestion and identification of recombinant plasmids

2.3 北冬虫夏草重组转化子的检验

用根瘤农杆菌AGL_pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1 对北冬虫夏草CM10（图4）孢子进行侵染，在无抗的平板上培养3 d 后，将玻璃纸转移至含相应抗生素的培养基平板上继续暗培养，待开始萌发白色菌丝点时，将拟转化子挑至含有Basta 抗生素的平板上培养。菌落形成后（图5），刮取拟转化子菌丝进行PCR 鉴定。将获得的抗性转化菌株连续传代，并进行PCR 鉴定（图6），在845 bp 大小处有目的条带的即为稳定菌株，选取3 代传代的稳定菌株进行后续实验。

图4 北冬虫夏草CM10 的菌落 Fig.4 Colony of C.militaris CM10

图5 Cmerg1 重组转化子的菌落 Fig.5 Colonies of Cmerg1 recombinant transformation

图6 Cmerg1 拟转化子菌丝PCR 的鉴定 Fig.6 Colony-PCR verification of Cmerg1 transformation candidates

2.4 qRT-PCR 检测基因相对表达量

以北冬虫夏草cDNA 为模板，分别以tef1-F/R、erg1-F/R 为引物，进行PCR 扩增检验引物特异性（图7a）。样品分为3 组不同处理的北冬虫夏草菌株，每组样品3 个平行，每个样品3 个重复，比较各样品（空白组、胁迫因子KMnO4组、胁迫因子NaCl 组）中erg1基因的相对表达量的差异（图7b）。结果显示，添加KMnO4环境因子后log2FC 是0.65（RNA-seq 中log2FC是0.95），添加NaCl 环境因子后log2FC 是1.54（RNA-seq 中log2FC 是1.56），erg1基因的表达水平与RNA-seq 的结果一致，表明转录组的数据是准确的。实时荧光定量PCR 分析表明，erg1基因表达量在添加KMnO4和NaCl 环境因子后上升，推测erg1基因与类胡萝卜素的生物合成有关，其具体的调控机制有待于进一步研究。

图7 erg1 引物鉴定及qRT-PCR 表达量验证 Fig.7 Primer identification of erg1 gene and qRT-PCR expression verification

2.5 转化子中类胡萝卜素含量的测定

对稳定遗传的第四代重组转化株Cmerg1 进行类胡萝卜素含量分析，结果表明高锰酸钾、氯化钠胁迫处理引起重组转化株Cmerg1 的类胡萝卜素的累积量增加（图8）。不添加任何胁迫的对照菌株类胡萝卜素累积量是3139.10 μg/g。高锰酸钾胁迫下，CM10 菌株、Cmerg1 菌株的类胡萝卜素累积量分别是5523.92 μg/g、6757.17 μg/g，Cmerg1 菌株是对照菌株CM10的1.22 倍；氯化钠胁迫使CM10 菌株、Cmerg1 菌株类胡萝卜素含量分别是5309.74 μg/g、6363.93 μg/g，Cmerg1 菌株是对照菌株CM10 的1.20 倍。先前有研究表明，Erg1（单氧酶）催化FPP 生成脱氢角鲨烯，促进C30 类胡萝卜素的合成[23]，本文与其研究结果一致。在添加高锰酸钾、氯化钠胁迫因子后重组转化株Cmerg1 类胡萝卜素的含量均发生了增加，与对照组菌株相比有显著性的差异变化，表明erg1基因过表达后北冬虫夏草Cmerg1菌株产类胡萝卜素的能力有上升，推测erg1基因促进类胡萝卜素的合成。

图8 北冬虫夏草CM10 和重组转化株Cmerg1 类胡萝卜素含量 Fig.8 Carotenoid production in mycelium of the C.militarisCM10 and Cmerg1

3 结论

3.1 基于前期转录组的数据分析，获得了参与北冬虫夏草类胡萝卜素合成的潜在基因erg1。本论文构建了erg1基因过表达载体 pCambia0390-blpR-Pcmgpd -erg1，通过农杆菌侵染的方式在北冬虫夏草中进行表达，然后摇瓶发酵测定北冬虫夏草类胡萝卜素生物合成量进行erg1的功能验证。结果表明，添加高锰酸钾、氯化钠胁迫因子后重组转化株Cmerg1 类胡萝卜素的含量均有显著增加，推测角鲨烯单氧酶Erg1 催化形成脱氢角鲨烯用于类胡萝卜素合成，该酶参与了北冬虫夏草类胡萝卜素的合成过程。

3.2 本研究构建的erg1基因的北冬虫夏草过表达载体及其突变株，为北冬虫夏草的基因过表研究提供了实验基础，有利于推进北冬虫夏草类胡萝卜素的生物合成机制研究和开发利用。