结肠癌患者BCL6B基因启动子区域甲基化检测结果分析

白雪，杜井峰

广东省深圳市深圳大学总医院消化内科，广东深圳518000

结肠癌是常发于直肠与乙状结肠交接处的消化道恶性肿瘤，以中老年患者居多，虽有研究报道，家族遗传、环境因素和生活习惯在一定程度上会影响肠胃健康，甚至导致消化道疾病，但是结肠癌具体的发病机制尚未明确[1-2]。抑癌基因是一种调节细胞增长分化、维持机体细胞稳定的、可抑制肿瘤细胞生长的基因，这类基因的突变、失活或缺失时会引起其内启动子区域高甲基化，抑癌功能丧失会引起细胞恶性转化导致肿瘤[3]。B细胞白血病/淋巴瘤6B（B-cell leukemia/lymphoma 6 member B,BCL6B）基因，位于17号染色体p13.1上，作为B细胞白血病/淋巴瘤6（B-cell leukemia/lymphoma 6,BCL6）家族一员具有抑制转录功能[3-4]。然而目前虽有研究报道称，BCL6与胃癌的生长及其预后相关，但其对结肠癌患者的作用机制尚未明确[4]。故此，该研究方便选取2018年6月—2020年6月56例在该院接受治疗的结肠癌患者进行分析，旨在探讨结肠癌患者BCL6B基因启动子区域甲基化情况，研究结肠癌发生及发展机制，以期为临床预防结肠癌发病及其治疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取在该院接受治疗的56例结肠癌患者，以其术后切除的癌组织和配对的癌旁组织为标本进行研究。纳入标准：①经病理检查确诊为结肠癌[5]；②男性34例，女性22例；③年龄44～80岁，平均（58.41±9.28）岁；④按TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期24例，Ⅲ、Ⅳ期32例；⑤有转移33例，无转移23例；⑥分化程度：高分化18例，中、低分化38例。排除标准：①已经或正在接受放化疗者；②伴有其他脏器合并症者；③精神障碍或其他不能配合治疗的情况者。同时期选取同数量在该院做健康体检的正常人，选取其肠镜活检的正常结肠黏膜组织对照研究。该研究符合医学伦理，患者及家属知情并同意。

1.2 方法

检测所用试剂购自天根生化科技(北京)有限公司的聚合酶链式反应（PCR）试剂和石蜡包埋组织DNA提取试剂盒，以及深圳华大基因有限公司的去甲基化引物。BCL6B基因非甲基化引物序列为5'-TTTTGTTTTGG ATTTGTTATTTGGAGAGT-3'(上游)和5'-CTTAACCTCAACTCCTTTATCTAACCA-3'（下游）；甲基化引物序列为5'-CGTTTTGGATTCGTTATTTGGAGAGC-3'（上游）和5'-CTTAACCTCAACTCCTTTATCTAACCA-3'（下游）。反应条件:95℃预性5 min，95℃下40 s，60℃下45 s，72℃下40 s，共循环35个PCR，最后72℃退火5 min。每项检测均设置阴性对照，甲基化引物扩增出条带为阳性，其余记为阴性[6]。

1.3 观察指标

观察结肠癌患者临床指标与BCL6B基因启动子区域甲基化关系；正常结肠组织、癌细胞组织与癌旁细胞组织BCL6B基因启动子区域甲基化情况（包括有无甲基化、甲基化阳性数量、甲基化率等）。

1.4 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件处理数据，计数资料用[n(%)]表示，采用χ2检验，事后经Logistic回归分析影响因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同患者BCL6B基因启动子区域甲基化率比较

结肠癌患者不同性别及年龄之间BCL6B基因启动子区域甲基化率比较,差异无统计学意义（P>0.05）；Ⅰ、Ⅱ期患者甲基化率（阳性）50.00%明显低于Ⅲ、Ⅳ期患者甲基化率（阳性）81.25%；高分化患者甲基化率44.44%明显低于中、低分化患者甲基化率78.95%；有发生淋巴转移患者的甲基化率78.79%（阳性）84.85%明显高于无淋巴转移患者的甲基化率（阳性）43.48%，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同患者BCL6B甲基化率比较[n(%)]

2.2 Logistic二次元分析影响BCL6B基因启动子区域甲基化的因素

通过Logistic进一步分析，结果显示，TNM分期、分化程度以及有无转移均为BCL6B基因启动子区域甲基化率的独立影响因素（P＜0.05），见表2。

表2 Logistic二次元分析影响BCL6B基因启动子区域甲基化的因素

2.3 正常结肠组织、结肠癌细胞系和结肠癌组织的BCL6B基因启动子区域甲基化状况比较

经PCR检测，相关指标解读为只能扩增出甲基化条带的阳性对照（IVD），正常人外周血淋巴细胞阴性对照（NL），灭菌双蒸水的空白对照（H2O），非甲基化条带（U），甲基化条带（M）。检测结果如下：图1a所示正常结肠组织的BCL6B未发现甲基化状况；图1b表示结肠癌细胞系甲基化状况，其中RKO、HT29为完全甲基化；图1c表示选取的56例结肠癌患者中BCL6B基因启动子区域甲基化38例，甲基化率67.86%，见图1。

图1 不同组织的BCL6B甲基化状况

3 讨论

结肠癌在我国恶性肿瘤榜高居不下，近年来，尽管经济条件、生活水平不断提高，但我国结肠癌的发病率未见改善。随着医的进步，虽然对于结肠癌的治疗效果有一定提高，但是目前临床对结肠癌的具体发病机制仍未明确，因此，探究与其发生、发展相关的分子标志物，对于结肠癌的治疗具有重要意义[4,7]。

近年来，随着研究的推进，表观遗传学在基因相关调控中的作用愈发重要[8]。有研究表明，肿瘤细胞基因异常甲基化与患者的性别、年龄、TNM分期、分化程度及有无转移等指标相关[9-10]。该研究表明，结肠癌组织BCL6B基因启动子区域甲基化率在TNM分期、分化程度及有无转移指标中相关；但与患者性别、年龄无关；且经Logistic回归二次分析可知，TNM分期、分化程度以及有无淋巴转移均可作为BCL6B基因启动子区域甲基化率的独立影响因素，这与邹庚艺、陈笑等[9-10]观点一致。

恶性肿瘤由于多种因素导致局部组织的细胞在基因水平上失去了正常调控，BCL6B基因与BCL6基因属于同源性细胞族群，其甲基化修饰是抑癌基因失活的一种表现[11-12]。该研究结果显示，未在正常结肠组织中发现BCL6B基因甲基化，而结肠癌细胞系内BCL6B基因甲基化率为67.86%，经去甲基化药物处理后BCL6B表达上升，表明结肠癌细胞内BCL6B启动子区域存在异常高甲基化状况。堵一乔等[12]认为BCL6B基因甲基化可作为辅助诊断CRC的较好指标，且明显可知健康人甲基化敏感度低至10%，而CRC患者甲基化率高达70%～100%，由此可明确，细胞BCL6B基因甲基化异常升高与是否罹患结肠癌，以及结肠癌严重程度息息相关。

综上所述，结肠癌的发生及发展与BCL6B基因启动子区域甲基化密切相关，BCL6B基因在结肠癌呈高甲基化，临床TNM分期过高、高分化及有淋巴转移均可影响甲基化，可为临床诊治结肠癌提供参考。但是该研究样本量较少，还需多角度多方面取样，进一步进行研讨。