血清miR-1182、CRNDE水平与鼻咽癌淋巴结转移的相关性

高 峰

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤，病因复杂，多认为与遗传、病毒感染等因素有关，流行病学调查显示，NPC发病率逐年升高[1]。NPC具有高度转移性、侵袭性，研究表明，60%～85%的患者就诊时，肿瘤已发生淋巴结转移，错失最佳手术治疗时机[2]。因此，明确可能导致NPC淋巴结转移的风险因子及预测因子，对指导早期合理治疗尤为重要。研究发现，易感TERT基因中多种靶微小核糖核酸(micorRNA，miR)与NPC的发展存在密切联系，miR-1182是易感TERT基因靶基因的一种，具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭等作用，可遏制肿瘤细胞进程[3-4]。结直肠肿瘤差异表达基因(colon rectal neoplasia differentially expressed，CRNDE)是LncRNA家族的一员，作用与促癌基因类似，已有研究证实，CRNDE在直肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤中呈过表达，且会增加预后风险[5]。结合miR-1182、CRNDE机制猜测，二者可能与NPC淋巴结转移存在一定关系，且可评估淋巴结转移风险，但与之相关研究的较少，且具体机制尚未明确。鉴于此，本研究通过观察NPC患者血清miR-1182、CRNDE表达情况，分析miR-1182、CRNDE表达与NPC淋巴结转移的关系，旨在为未来NPC淋巴结转移早期预测与治疗方案的拟定提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻选取医院2018年4月至2020年5月收治的93例NPC患者为研究对象。93例患者中男性52例，女性41例；年龄43～65岁，平均(54.40±3.38)岁；入院时卡氏(Karnofsky，KPS)[6]评分52～83分，平均(67.87±4.57)分；TNM分期[7]：Ⅰ期19例，Ⅱ期23例，Ⅲ期34例，Ⅳ期17例。本研究的实施经医院伦理委员会批准，患者及家属均知情本项研究，并签署研究知情同意书。

1.2 入选标准

①纳入标准：符合《现代肿瘤学(第三版)》[8]中NPC相关诊断标准，且经穿刺活检确诊为低分化鳞癌；均为原发性肿瘤；精神正常，可正常配合交流；生活可自理。②排除标准：合并胃癌、结肠癌等其他恶性肿瘤；合并先天性心脏病、肾衰竭等重要脏器病变；入组前接受放化疗治疗；合并感染性肺炎、乙肝等感染性疾病。

1.3 方法

1.3.1 淋巴结转移评估及分组 患者就诊均接受CT检查，结合影像学表现及相关标准[9]，评估患者淋巴结转移情况：①横断面淋巴结最小横直径≥10 mm；②影像学检查可见淋巴结中心坏死或呈环形强化；③1个区域内存在≥3个淋巴结聚集、簇拥，且最小直径≥8 mm；④淋巴结边缘呈不规则强化，四周脂肪间隙全部或小部分消失；⑤咽喉部淋巴结最小直径>4 mm。符合上述标准即判定为淋巴结转移，纳为淋巴结转移组，反之则纳为淋巴结未转移组。

1.3.2 血清miR-1182、CRNDE检测 于患者入院第2天，取晨起空腹肘静脉血5 ml，置于肝素抗凝管内，采用低速离心机以4 000 r/min转速分离10 min，采集血清，置于-80 ℃冰箱内贮存、待检；采用mirVana PARIS试剂盒提取血清miR-1182、CRNDE总RNA，然后用UL2000超微量分光光度计测定各RNA浓度，选取吸光度范围为1.8～2.0的样本，应用逆转录试剂盒将其转录为cDNA；将cDNA作为模板，GAPDH作为参照，采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒、荧光定量分析仪对样本进行实时荧光定量检测，设定对应合成引物及片段，PCR反应体系为10 μL，细分为cDNA样本1 μL，10 μmol/L上游引物、下游引物各1 μL，2.5×dNTPMIX 4 μL，RNase-free H2O 2 μL，primeSTAY 1 μL；循环参数设定：先于90 ℃下预变性30 s，后于95 ℃下循环5 s、65 ℃下循环30 s、72 ℃下循环5 s，共设定40个循环，最后在4 ℃下延伸10 min；采用StepOneTM软件收集信号，以熔解曲线分析样本表达，miR-1182相对表达量用Log102-△Ct法计算，CRNDE表达量用2-△△Ct法计算。

1.3.3 基线资料调查 设计基线资料填写表，询问并记录NPC患者基线资料，内容包括：一般资料[性别(男、女)、年龄、入院时KPS评分、TNM分期(Ⅰ～Ⅳ期)、合并症(高血压：收缩压水平≥140 mmHg，舒张压水平≥90 mmHg；糖尿病：空腹血糖水平≥7.0 mmol/L)]、实验室指标[血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)：取患者空腹肘部静脉血5 ml，以4000 r/min转速分离10 min，采集血清用酶联免疫吸附法测定]等。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 NPC患者淋巴结转移情况

93例NPC患者中有56例淋巴结转移，转移率为60.22%(56/93)。

2.2 淋巴结转移及未转移NPC患者相关基线资料比较

淋巴结转移组VEGF、CRNDE表达高于未转移组，miR-1182表达低于未转移组，差异有统计学意义(P<0.05)。组间其他基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 淋巴结转移、未转移NPC患者相关基线资料比较

2.3 各主要指标与NPC患者淋巴结转移关系的回归分析

将2.2中比较差异有意义的变量纳入作为自变量，将NPC患者淋巴结转移情况作为因变量(1=转移，0=未转移)，经二元Logistic回归分析后，将2.2中全部资料纳入，建立多元回归模型，结果显示，VEGF、miR-1182、CRNDE异常表达可能与NPC患者淋巴结转移有关，VEGF过表达、miR-1182低表达、CRNDE过表达可能是NPC患者淋巴结转移的风险因子(OR>1，P<0.05)。见表2。

表2 各主要指标与NPC患者淋巴结转移关系的回归分析结果

2.4 血清miR-1182、CRNDE预测NPC淋巴结转移风险价值分析

绘制ROC曲线发现(见图1、2)，miR-1182、CRNDE预测NPC淋巴结转移风险的AUC分别为0.809、0.808，均有一定预测价值，且在二者cut-off值分别取0.585、3.565时，取特异度、灵敏度。相关参数见表3。

表3 血清miR-1182、CRNDE预测NPC淋巴结转移风险价值分析结果

图1 miR-1182预测NPC淋巴结转移风险预测价值ROC曲线图

图2 CRNDE预测NPC淋巴结转移风险价值分析ROC曲线图

3 讨论

放射治疗是NPC首选治疗方案，明确肿瘤侵袭范围、淋巴结转移情况，对拟定合理治疗方案具有重要指导作用。淋巴结转移是NPC常见特征，研究显示，23.9%～75%的NPC患者首发症状即为淋巴结转移，这类患者因早期无特异性表现，可能无法接受理想的针对性治疗，且治疗难度较高，预后相对较差[10]。因此，积极找出可能导致NPC患者淋巴结转移的影响因子及可能的预测因子，对指导疾病的早期防治意义重大。

TERT基因是NPC患者主要易感基因之一，其表达与肿瘤细胞发生、发展及患者预后均有一定关系，可作为NPC预后评估新型标志物[11]。miR-1182是TERT基因的一种靶标miR，其表达可反映TERT基因水平，据报道，miR-1182可结合TERT基因中3UTR区域，抑制TERT基因反转录，且可削弱肿瘤细胞增殖能力，从而阻止肿瘤进展[12-13]。章凯等[14]研究显示，NPC患者血清miR-1182显著低于健康人，且该基因表达量与TNM分期、淋巴结转移等均呈负相关。CRNDE作为长链非编码RNA，最早发现于结直肠癌组织中，但随着临床深入研究发现，CRNDE在多种恶性肿瘤中均有表达，且可通过多种渠道调节肿瘤细胞功能，影响患者预后[15]。Yang等[16]研究发现，宫颈癌组织中CRNDE呈高表达，且其表达情况与疾病分期、淋巴结转移均存在一定关系。潘国刚等[17]研究发现，NPC患者血清CRNDE表达量高于健康人，且早期检测CRNDE有助于评估NPC病情，指导临床干预。结合miR-1182、CRNDE在NPC患者血清中表达及二者作用机制猜测，二者与NPC淋巴结转移存在一定关系。

为证实猜测，本研究初步比较发生淋巴结转移与未发生转移患者的基线资料及实验室主要指标，结果显示，淋巴结转移组CRNDE表达高于未转移组，miR-1182表达低于未转移组，初步表明CRNDE、miR-1182与NPC淋巴结转移有关，可能参与了NPC淋巴结转移过程；经二元Logistic回归分析后建立多元回归模型，结果显示，miR-1182低表达、CRNDE过表达均可能是NPC患者淋巴结转移的风险因子，并在进一步的ROC曲线绘制后发现，CRNDE、miR-1182表达用于预测NPC患者的淋巴结转移有较理想的价值，当miR-1182、CRNDE cut-off值分别取0.585、3.565时，可获得最佳预测价值，且随着miR-1182水平降低、CRNDE水平升高，淋巴结转移风险增加，证实猜测。

除miR-1182、CRNDE外，本研究还发现，VEGF过表达也会增加NPC淋巴结转移风险。VEGF是作用较强的促血管生成因子，该因子过表达可能会促进肿瘤新血管生成，提高血管通透性，且可使肿瘤细胞侵入脉管系统，推进肿瘤细胞转移。而肿瘤新血管生成是肿瘤细胞转移、生长重要途经，不仅可为肿瘤细胞提供生长所需营养，还可促进肿瘤细胞扩散，从而增加NPC淋巴结转移风险[18]。但本研究经二元Logistic回归分析并建立Logistic多元回归模型分析发现，VEGF过表达带来的影响不及miR-1182、CRNDE，故未将其作为主要分析指标，故关于VEGF在NPC患者淋巴结转移中的应用价值还需进一步验证分析。

综上所述，NPC患者就诊时多数已伴有淋巴结转移，可能与miR-1182低表达、CRNDE过表达有关，考虑未来可通过检测NPC患者就诊时血清miR-1182、CRNDE水平，辅助评估患者淋巴结转移情况，可能对指导早期合理治疗展开有积极意义。