叶酸缺乏导致正常喉黏膜P15基因CpG岛甲基化与喉癌发生发展的相关性

赵 鹏 曾 萍 彭德新 彭丽香

喉癌的发生机制主要有遗传学与表观遗传学，DNA甲基化导致抑癌基因失活是喉癌发生发展的主要原因之一。研究显示叶酸缺乏可以干扰DNA甲基化而参与喉癌的发生过程[1]，表观遗传学数据进一步提示抑癌基因启动子去CpG岛的异常甲基化修饰是肿瘤形成的重要原因[2]。P15、P16基因编码的蛋白属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)家族，特异性抑制细胞周期蛋白D(CyclinD)与细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)的结合，从而阻止细胞周期由G1期进入S期，呈现抑癌基因的作用。P15基因在多种肿瘤发生中起重要作用，其失活机制主要是缺失、突变和启动子区甲基化。大量研究表明P15基因启动子区域5’CpG岛的异常甲基化也是基因失活的主要机制[3]。叶酸缺乏与喉癌的发生相关，但叶酸与P15的关系目前报道少见，本次研究主要探索叶酸缺乏与P15基因启动子区CpG岛异常甲基化在喉癌发生发展中的作用，为揭示喉癌的发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常喉黏膜细胞购自INCELL(TX，USA)，由江西省肿瘤医院头颈外科提供70例喉鳞状细胞癌组织，另取10例癌旁正常喉黏膜组织为对照组。所用标本均经病理学确诊。所有患者术前均未接受放化疗或其他治疗，新鲜标本离体后迅速放入液氮罐。70例中，男性65例，女性5例；<60岁者19例，≥60岁者51例；TNM 分期：早期(Ⅰ～Ⅱ期)26例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)44例；病理分级：高分化15例，中分化25例，低分化30例；30例有淋巴转移，40例无淋巴转移。DNA甲基化试剂盒(Sigma 公司，美国)，所用引物购自上海生物工程股份有限公司。本实验选用的培养6周的正常喉黏膜细胞进行低叶酸浓度下的甲基化芯片分析。芯片分析委托上海康成生物技术有限公司完成。

1.2 细胞培养

喉正常黏膜细胞冻存于液氮中，取出后置于37 ℃恒温水浴箱中解冻复苏。1000×g离心10 min，更换添加了低浓度叶酸(20 nM)的含10%(V/V)胎牛血清细胞培养基，培养条件为37 ℃、5% CO2浓度。

1.3 甲基化P15特异性引物序列

正向5’-tggtcttgacctctctgc-3’，反向5’-agcgaattcgggtgggaaattgggtaagaa-3’，扩增产物长度 323 bp。甲基化反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s甲基化：54 ℃ 30 s非甲基化，72 ℃ 30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0软件，各基因甲基化水平数据以均值±标准差表示，多组间比较采用重复测量方差分析，两两比较采用q检验；P15启动子甲基化结果、mRNA表达水平与临床病理变量的关系以计数资料表示，并采用卡方检验或秩和检验进行统计分析。检验水准取α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲基化芯片数据

应用甲基化芯片技术从低叶酸浓度培养的喉黏膜细胞筛选到了11个基因启动子区CpG岛发生了超甲基化的改变(表1)，其中P15、PTEN、FHIT、RUNX3、CDH1、P16、MGMT、DAPK变化均有统计学意义(P<0.05)。

表1 甲基化芯片技术筛选低叶酸浓度培养的喉黏膜细胞基因启动子区CpG岛甲基化改变

2.2 P15基因甲基化在喉癌及正常喉黏膜组织中表达情况

与正常喉黏膜组织相比，P15基因甲基化现象在喉癌组织中发生率更高(P=0.001)，见表2。

表2 P15基因甲基化在喉组织中的表达情况/例

2.3 P15基因甲基化与喉癌临床病理特征的关系

P15基因甲基化与喉癌性别、年龄、肿瘤分化程度和肿瘤分期等临床病理特征均无明显的统计学关系，见表3。

3 讨论

喉癌(carcinoma of larynx)是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤，据国内各地统计占耳鼻咽喉部位恶性肿瘤的7.9%～35%，排头颈部恶性肿瘤的第三位[4]。DNA甲基化是表观遗传修饰中最重要的组成部分，在人类肿瘤的进展中起着至关重要的作用，是当前新的研究热点之一[5]。现在日趋成熟的表观遗传分析与甲基化基因芯片的应用可以对大量的DNA甲基化进行定性和定量分析。许多研究表明，抑癌基因的启动子在正常细胞组织中是处于低甲基化的，而在肿瘤细胞内或是叶酸缺乏时是处于高甲基化的状态，这种高甲基化易使抑癌基因的表达产物下降，从而促使肿瘤细胞增殖[6-8]。同样应用去甲基化的药物可以去除抑癌基因的高甲基化状态，激活该抑癌基因，达到抑制肿瘤的发展[9-10]。本研究显示在低叶酸的环境下正常的喉黏膜细胞的P15基因CpG岛异常高甲基化状态。近期的研究表明，DNA甲基化与肿瘤的关系越来越受到人们的关注，尤其是一些重要的抑癌基因启动子区CpG岛高甲基化，通常被认为是肿瘤抑制基因沉默的重要机制[11]。P15基因是位于9P21染色体，其启动子区CpG岛高甲基化导致转录水平基因的失活，与众多肿瘤的发生均有关系。

Wang等[12]用MSP的方法检测了头颈部肿瘤73例(其中喉癌11例)中P16和P15基因甲基化改变，结果显示肿瘤组织中有P16和P15基因甲基化率为49%与60%。Sanchez-Cespedes等[13]用甲基化特异性PCR检测了95例头颈部肿瘤(其中喉癌17例)中的P15、P16、DAPK、MGMT的甲基化程度，其中有高达55%出现异常高甲基化。本实验研究结果也显示喉癌组织中的P15基因启动子区CpG岛高甲基化要明显高于正常喉黏膜组织细胞。综上实验提示血清叶酸缺乏与P15基因启动子区CpG岛高甲基化在喉癌病变中是起着协同作用的。

本研究是通过高通量的基因芯片的方式筛选出多个潜在的肿瘤发生发展相关的基因，这种方式即快速锁定相关基因又节省了相当多的人力成本，充分说明了甲基化芯片在DNA甲基化的整体筛查方面有用独特的优势。基因启动子区的甲基化状态改变早于细胞恶化，由于甲基化是一个可逆的基因修饰过程，因此通过逆转DNA的甲基化状态对喉癌进行治疗是值得期待的，同时对肿瘤相关基因的甲基化的检测有助于喉癌的早期诊断和治疗。