补肾解毒通络方阻止白血病复发机制的网络药理学分析

2021-10-09孙维龙许鑫欣陶霞施伟鹏竺佳范晨阳李帝萱杨向东

中医药信息 2021年6期

孙维龙，许鑫欣，陶霞，施伟鹏，竺佳，范晨阳，李帝萱，杨向东

（天津中医药大学第一附属医院，国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381）

临床中化疗是成人急性白血病（AL）治疗的主要选择，但预后通常不容乐观［1-2］。急性髓细胞性白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）的长期缓解率水平很低，尤其ALL 的长期缓解率仅为30%～40%，化疗后复发仍是困扰AL 治疗的重要问题［3-4］。在骨髓中，对造血干细胞（HSC）的增殖、分化、存活和归巢起支持作用的最小解剖结构是骨髓微环境（即龛）。这个微环境由骨细胞、血管周细胞、骨内膜细胞、脂肪细胞、巨噬细胞以及间充质干细胞等共同构成［5］。其中，间充质干细胞（MSC）与HSC 的关系尤为密切，它可以通过物理支持和分泌可溶性因子来调控HSC 的维持和分化，是龛中的关键元素［6］。在白血病进程中，白血病干细胞（LSC）会通过“劫持”作用将龛改造为适合LSC 生长并改变HSC 功能的环境［7］。不同的细胞因子利用多种途径实现了这种作用，并由此介导了LSC的动员、归巢和耐药性，最终成为临床复发的重要原因［8］。针对被“劫持”龛的治疗，可能为治疗白血病复发提供新的研究方向［9］。

现代中医药作为中国传统医学的发展和延伸，是我国临床医学的重要组成部分。癌症的临床治疗中，中医药凭借增效减毒、预防复发、延长生存时间等多方面的优势，发挥着独特的补充作用［10］。其中，补肾解毒通络方对于延长复发难治白血病患者生存周期的效果显著［11］。在前期研究中，笔者证明了补肾解毒通络方（BSJDTLF）对辐射后小鼠的MSC 具有修复作用，并能在MSC 与K562 细胞的共培养中下调白血病相关基因［12］。这为研究BSJDTLF 的药理机制提供了实验基础。

随着实验技术与信息技术的发展，中医药的研究已经从传统的“单一药物”“单一靶点”过渡到“多组分”“多靶点”的网络药理学研究模式。网络药理学在中药靶点预测、生物活性化合物筛选、毒性评价、机制研究等方面发挥了巨大的作用，为中医药复方的研究提供了新的策略［13-14］。同时，基于高通量测序技术的发展，蛋白组学、基因组学也越来越多参与疾病研究，尤其是肿瘤的研究中［15-16］。其中蛋白组学可以实现对细胞和组织内复杂的蛋白质进行全面的定性和定量分析，较为全面的覆盖不同样本中蛋白质的变化关系［17］。因此，高通量蛋白组学可以从侧面验证网络药理学的筛选成果。在本研究中，笔者首先基于质谱分析明确BSJDTLF 的化合物成分，再通过网络药理学与蛋白质组学相结合的方法，研究BSJDTLF 与白血病之间的关系，并对其作用机制、靶点进行预测。具体研究流程见图1。

图1 研究分析的流程图

1 材料和方法

1.1 BSJDTLF中化合物的鉴定

1.1.1 BSJDTLF的药物组成

组方：全蝎10 g，僵蚕10 g，鹿角片15 g，龟甲15 g，白附子10 g，人参10 g，枸杞子10 g，滑石10 g，青黛5 g，甘草5 g。药物来源于天津中医药大学第一附属医院中药房。

1.1.2 BSJDTLF的样品制备

取复方药粉10 g加100 mL水煎煮30 min，煎煮后约得50 mL提取液，在旋转蒸发仪45 ℃水浴上浓缩至一定体积后的复方浓缩液，将浓缩液放入培养皿中，在-80 ℃冰箱预冷冻后，放入冻干机至过夜冻干，取出冻干后的样品密封保存待用。精确称取10.00 mg 样品至离心管中，加入1 mL 超纯水溶解，离心（14 000 rpm/min，20 min，4 ℃），取上清液100 μL至进样小瓶中，以超纯水作为空白溶剂，进样。

1.1.3 质谱条件

质谱分析在Thermo Fisher Q-Orbitrap MS（QExative）系统下完成，离子源为高能电喷雾离子源（HESI 源），扫描模式为Full-ms/ dd-ms2，正负离子模式下同时采集。源参数：源喷雾电压（spray voltage）正离子为3.5 kV，负离子为2.8 kV，毛细管温度（capillary temperature）320 ℃，离子源加热温度（probe heater temperature）350 ℃，鞘气（sheath gas，N2）为35，辅助气（auxiliary gas，N2）为10，S-lens 水平为50 V，碰撞能量为20、40、60 V，扫描范围为m/z 100～1 500，分辨率为70 000。

1.1.4 质谱仪器

超高效液相色谱质谱联用仪UHPLC-/ESI-QOrbitrap MS（美国Thermo Fisher Scientific）；3K15 型高速离心机（美国Sigma 公司）；KQ-250E 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；AX 205 型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；BP121S 型万分之一天平（德国Sartorius 公司）；XW-80A 型涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）；日本东京理化EYELA 旋转蒸发仪DPE-2150（山东爱博科技贸易有限公司）。

1.1.5 数据处理与分析

将采集到的原始数据利用Xcalibur（4.2，Thermo-Fisher Scientific）软件进行数据记录、分析及处理，化合物的鉴定是基于文献基础，根据化合物的质荷比、二级碎片进行。

1.2 化合物相关靶点的收集

质谱结果中化合物的相关靶点是在TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）与CTD（http：//ctdbase.org/）两个数据库检索得到的。检索结果通过Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库统一为基因名称。并对统一名称后的靶点与化合物对应关系进行了合并，并删除了重复项。

1.3 已知白血病相关靶点的收集

通过“leukemia”为关键词在NCBI（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/gene/）于GENE CARD（https：//www.genecards. org/）两个数据库中进行了搜索，去除了搜索结果中的重复基因，整合了两个数据库共有的2 864个靶点。

1.4 蛋白质组学

实验中的蛋白质组学测定是委托天津舍维斯生物技术有限公司进行（项目编号：QLSWS003-20190614001），采用了由ABSCIEX公司研发的iTRAQ技术。

1.5 GO、KEGG和关键子网络的分析

首先使用STRING（https：//string-db.org/）数据库进行了PPI 分析，并得到了相关靶点的功能和通路富集。随后，将PPI 关系导入Cytoscape 3.7.1 中进行了网络图的绘制，使用MCODE 插件对其核心子网络进行筛选。

1.6 实验动物

7 周龄的雄性BALB/c 小鼠，SPF 级，体质量（22±2）g，北京华阜康科技股份有限公司，许可证编号SCXK-20190008。饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物中心SPF级屏障内，给予常规饮食，定期更换垫料。

1.7 分组及给药方法

采用随机分组法分为给药组与对照组（n=6），给药组给予BSJDTLF（以10 g/50 mL 的浓度制作水煎剂）灌胃，每天1 次，每次0.2 mL。对照组给予生理盐水（NS）灌胃每天1 次，每次0.2 mL。4 周后统一处死小鼠，并提取MSC。

1.8 小鼠MSC的提取和培养

在无菌条件下从小鼠骨髓中提取髓内细胞，使用针对小鼠MSC 的选择培养液MesenCult 套装（STEMCELL CAT#05513）配合贴壁法对MSC 进行纯化培养。所用MSC均遵照以上方法进行了3次传代。

2 结果

2.1 BSJDTLF中化合物的鉴定

BSJDTLF 的水溶液10 g/50 mL，经过浓缩、冻干制取上机样本。随后使用超高效液相色谱质谱联用仪对样本进行检测。将采集到的原始数据利用Xcalibur（4.2，Thermo-Fisher Scientific）软件进行数据记录、分析及处理。其中化合物的鉴定是基于文献的基础，根据化合物的质荷比、二级碎片进行的。通过准确的分子离子质量及二级碎片进行分析，数据精度误差阈值在5 ppm以内，共鉴定出182个化合物，鉴定结果见图2。

图2 正、负离子模式下的水提物总离子流图

2.2 BSJDTLF中化合物的靶点

使用TCMSP与CTD数据库［18］，在数据库中检索与质谱结果中182个化合物相关的靶点，将这些靶点结果通过Uniprot及DAVID数据库统一为基因名称。去除重复项后，共得到与其中100种化合物相关的1 969个靶点。

2.3 BSJDTLF与白血病相关靶点的筛选

以“leukemia”为关键字，分别在NCBI GENE 与GENE CARD 数据库中检索，其中，在NCBI 中检索到29 693 个结果，在GENE CARD 检索到15 655 个结果。为了增强疾病与基因的相关性，笔者对两个数据库的检索结果进行了交集比对，再去除重复项后，共得到了2 864个共有靶点作为白血病相关靶点使用。随后，将在TCMSP与CTD数据库得到的BSJDTLF中化合物相关基因（1 969个）与2 864个白血病相关靶点进行比对，共筛选到了623个靶点。这些靶点可能揭示BSJDTLF 作用于白血病、延缓复发的具体机制。见图3。

图3 BSJDTLF中化合物1 969个靶点与NCBI和GENE CARD中白血病相关基因的交集

2.4 BSJDTLF给药小鼠MSC的蛋白质组学分析

通过质谱与数据库分析筛选到了623 个BSJDTLF作用于白血病的可能靶点。但是这种基于已有实验的数据库分析可能存在偏差，为了进一步验证BSJDTLF对于MSC 的作用关系，本研究采用iTRAQ（isobaric tagsf or relative and absolute quantitation）技术对BSJDTLF 灌胃小鼠及NS 灌胃小鼠的MSC 进行了蛋白质组学分析，以明确其产生差异的靶点。iTRAQ 是一种相对和绝对定量的高通量分析方法，目前被广泛的运用到癌症，尤其是白血病的研究中［19-20］。

将未经处理的7 周龄BALB/c 小鼠随机分为两组（n=6），分别给予BSJDTLF 和NS灌胃（0.2 mL/d）。给药28 d 后，处死小鼠并提取骨髓细胞，使用选择培养液，通过贴壁法对小鼠的MSC 进行了选择性扩增。在得到满足蛋白质组学实验所需数量的细胞后，使用iTRAQ 技术将两组样本进行了高通量蛋白质组学测定。对两组的蛋白质组学数据进行比对后，共得到了728 个差异蛋白（差异性＞1.2）。这些差异蛋白为进一步分析BSJDTLF 作用于白血病的潜在靶点提供了实验证据。

2.5 BSJDTLF潜在靶点的分析

将数据库中BSJDTLF 与白血病相关的623 个靶点同蛋白组学产生差异的728 个蛋白进行了比对、分析。再去除重复结果后，共得到了50 个共表达的基因（见图4）。这50 个共表达基因可能成为揭示BSJDTLF 作用途径的潜在靶点。在筛选出补肾解毒的潜在靶点后，通过STRING 对这些靶点进行了PPI 与功能、通路的富集分析，随后使用Cytoscape 对个网络进行了优化。见图5。

图4 数据库、疾病相关基因、蛋白质组学的结果进行交集比对图

图5 50个潜在靶点的PPI网络图

通过Cytoscape，同时也构建出了这50个潜在靶点与BSJDTLF 中化合物的关系，这些靶点共与29种化合物相对应。见图6。

图6 潜在靶点与相关化合物的网络图

此外，本研究还使用STRING 对潜在靶点进行了GO 条目下功能注释的富集分析。从细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）三个部分描绘了潜在靶点的功能富集（见图7）。在这三个方面本研究着重于BP 部分的功能富集，其中在“strength”值排名前15 的条目中包含了肿瘤坏死因子产生、调控及自噬细胞相关（GO：0032640、GO：1903265、GO：0048102）。见表1。

表1 功能富集中与生物过程有关的排名前15的条目

图7 潜在靶点的功能富集分析图

在KEGG通路富集分析中，选取了排名前15的通路，错误发生率（false discovery rate）均＜0.01。通路中包含了与慢性白血病（mmu05220）、凋亡（mmu04215）、急性白血病（mmu05221）、VEGF（mmu04370）相关的通路。见表2。

表2 通路富集中排名前15的KEGG通路

2.6 潜在靶点K-Core核的分析

选取Cytoscape3.7.1 中的MCODE 插件对50 个潜在靶点进行K-Core 分析。K-Core 是一种分解相互作用的网络关系的拓扑分析，可以在复杂的网络关系结构中寻找到重要的节点［21］。在置信度＞15，KCore为2的条件下，筛选出了潜在靶点PPI网络中的核心子网络（见图8）。这个核心子网络中，包含了10 个靶点：Mmp2、Stmn1、Icam1、Creb1、App、Alb、Cdk1、Dnmt1、Fth1、Rela。通过中心性计算，Icam1、Alb、Rela 三个靶点的中介中心性最高。这个核心子网络中的节点，尤其是Icam1、Alb、Rela 及相关基因可能是BSJDTLF的作用靶点。

图8 50个潜在靶点的K-Core

3 讨论

在本研究中，首先通过液相色谱质谱分析BSJDTLF 中的化学成分，共发现182 种化合物。在TCMSP 和CTD 中将这些化合物的靶点进行检索，得到了与之相关的1 969个靶点。将1 969个靶点与白血病相关靶点和蛋白质组学的差异蛋白进行了比对，筛选出50 个潜在靶点。最后，对这些潜在靶点进行了功能富集、通路富集、PPI和K-Core方面的数据分析。

在功能富集分析中，首先着重于BP 部分的内容。此部分排名前15 的条目中，发现了与肿瘤坏死因子（TNF）相关的富集（GO：0032640、GO：1903265）。TNF被证明与白血病的关系密切，它参与白血病发生的所有步骤，包括细胞转化、增殖、血管生成和髓外浸润［22］。尤其在白血病干细胞（LSC）对骨髓微环境的改造中，TNF 与其他因子共同诱导了MSC 的改变［23］。抑制TNF-1α 的表达可以增强化疗对白血病干细胞的作用，减少耐药性，因此TNF 可以作为白血病治疗的靶点［24］。在中医药的有关研究中，有证据表明人参皂苷可以对白血病细胞的TNF 产生影响，从而抑制LSC 的增殖［25］。

在KEGG 分析中，除去慢性白血病（mmu05220）、急性白血病（mmu05221）的相关通路，VEGF 信号通路（mmu04370）也应引起重视。在非肿瘤化的龛中，VEGF 参与介导MSC 的增殖与分化，对机体的功能修复起到正向作用［26-27］。然而在被白细胞作用的微环境中，VEGF 产生了异常的上调［28］。这种上调介导的血管重塑构建了针对HSC 的“陷阱”，使得MSC 对HSC 的支持作用减弱，同时又保护了LSC 免于化疗杀伤［29］。而对于VEGF 的靶向治疗大多数基于已有药物的联合用药［30-31］。这些药物虽然可以抑制白血病中VEGF 的分泌，延长了患者的生存时间［32］。但是，针对VEGF 的靶向药物或减缓联合用药副作用的研究仍有很大的空间［32］。

在PPI分析中，使用K-Core对潜在靶点互作网络的核心子网络进行了筛选，这个子网络共包含了10 个节点：Mmp2、Stmn1、Icam1、Creb1、App、Alb、Cdk1、Dnmt1、Fth1、Rela。其中，Icam1、Rela 是两个中介中心节点。Icam1（即CD54），可被IL-1 和TNF 诱导，并被巨噬细胞、淋巴细胞和基质细胞表达［33-34］。在白血病中，Icam1 也被证实与白血病细胞对龛的改造相关，白血病细胞会分泌刺激因子增强Icam1 的分泌水平，从而促进其与龛的黏附［35］。但是，针对Icam1 的靶向治疗研究进展并不顺利，这源于其在正常的龛和肿瘤化的龛中扮演的不同角色［36］。Rela（p65）是NF-κB的结合因子，在研究中被证明与MSC 的增殖、分化关系密切［37］。在癌症环境下，Rela 的激活可以促进MSC 的肿瘤化［38］。白血病的临床治疗中，伊马替尼耐药白血病细胞内的Rela 的表达水平明显上调［39］。针对Rela的靶向治疗可能为白血病提供一种新的治疗方案［40］。此外，也有文献报道在急性白血病中Rela 与TNF 存在高度相关性［41］。这与笔者在功能富集分析结果中出现TNF的相关条目相对应。

相关实验文献验证了笔者筛选的潜在靶点与白血病的相关性以及在白血病治疗中的潜在价值。针对疾病多靶点的调控研究是近年来中医药研究的主要方向之一，在多种癌症的治疗方面取得了进展［42-43］。同时，中药在疾病中的双向调节作用也被越来越多的研究证明［44］。中药的双向调节作用是否会在多靶点的调控中发挥独特的作用，这种调节能否运用到白血病的治疗中？这为今后的研究提出了方向。

综上所述，本研究通过网络药理学与蛋白组学相结合的方法，从理论和实验验证方面筛选出了BSJDTLF 的潜在靶点。还通过文献挖掘，分析结果中的功能富集、通路富集和PPI 节点在白血病中的作用。这些研究为进一步揭示BSJDTLF 的作用机制提供了科学依据。在后续的研究中，笔者将利用白血病小鼠模型对筛选出的潜在结果进行验证。