凉血通瘀方对脑出血大鼠脑组织TLR4和NF-κB p65的影响

王君君，李建香，张子健，过伟峰*

（1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023；2. 南京中医药大学附属南京中医院，江苏 南京 210023）

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种原发性非外伤性脑实质内出血，在我国约占全部卒中患者的20%～30%［1］，急性期病死率约30%～40%，预后不良，甚则致残。脑出血后数分钟即可产生血肿占位，颅内压升高，继而出现低灌注，浸润组织产生炎性反应［2］。国医大师周仲瑛创立的凉血通瘀方具有通腑泄热、凉血化瘀之功效，笔者应用此方治疗急性脑出血，前期临床研究观察证实其有助于改善神经系统症状体征，减轻病情，改善预后［3］，实验研究有抗炎效应［4］。本研究采用凉血通瘀方干预脑出血大鼠模型，观察其对脑组织TLR4 和NF-κB p65 的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

健康雄性成年SD大鼠24只，体质量220～300 g，购自江苏省青龙山动物繁育中心，许可证号：SCXK（苏）2017-0001。置于南京中医药大学实验动物中心饲养：5只大鼠为一笼，不限制饮水、摄食，给予恒温恒湿、12 h光照与12 h黑暗交替环境。本实验方案经由南京中医药大学实验动物伦理委员会审核，批准号为：201905A041。

1.2 实验药物

凉血通瘀方药组成：熟大黄10 g，水牛角（先煎）30 g，生地黄20 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g和石菖蒲10 g，购自安徽沪春堂中药饮片有限公司。制成每毫升含1.1 g鲜药的水煎剂药液，放置于冰箱4 ℃保存备用。

1.3 实验试剂

蛋白酶抑制剂混合物（货号：P1005）、裂解液（货号：P0013B）、PMSF（货号：ST505）、蛋白Marker（货号：P0075）、4 × 上样缓冲液、BCA 蛋白浓度测定（货号：P0010S）、β-巯基乙醇（上海碧云天生物技术有限公司）；过硫酸铵、Tween-20（北京索莱宝科技有限公司）；TLR4 抗体（货号：ab217274）、羊抗兔IgG H&L 二抗（货号：ab6721）、内参抗体（货号：ab181602）［艾博抗（上海）贸易有限公司］；SYBR Premix Ex Taq，RT Master Mix（日本Takara 公司）；TLR4、GAPDH 引物（上海生工生物工程有限公司设计）。

1.4 实验仪器

注射泵控制器（型号TJ-1A，保定兰格恒流泵有限公司）；脑立体定位仪（型号990-685，加拿大David Kopf Instruments 公司）；多功能开颅钻（型号Thakita 6222D，日本Makita 公司）；50 μL 微量进样器（上海光正医疗仪器）；电子天平（型号：CPA1003P，德国Sartorius）；酶标仪（美国PerkinElmer，型号：PE）；球磨仪（Retsch，型号：MM400）；微型垂直电泳系统（Bio-Rad，型号Min i-Protoan T cua）；蛋白半干转印仪（Bio-Rad，型号：170-3940）；离心机（Eppendorf，型号：5417R）；超灵敏发光成像仪（GE，型号：LAS4000）；振荡器（海门其林贝尔，型号：vortex-5）；7500 Real Time PCR仪（ABI 公司）。

2 方法

2.1 动物造模及给药

在动物中心适应性饲养1 周后，将24 只健康成年SD 大鼠随机分成正常组、假手术组、模型组和凉血通瘀组，共4 组，每组6 只。模型组和凉血通瘀组采用注射泵控制器注血/二次退针法制作脑出血模型［5］：调整立体定向仪，使门齿钩低于耳间线2.4 mm；麻醉仰卧固定，头部正中切开，定位右侧尾状核（前囟点右侧中线旁开3 mm、冠状缝前0.2 mm），钻孔；翻转分离尾动脉，微量进样器穿刺抽血50 μL，固定于立体定位仪，颅骨表面与进针相距6 mm，注射泵以10 min匀速注血50 μL，留针10 min，退针2 mm，再留针5 min，缓慢退针，无菌骨蜡封闭，缝合皮肤。

按照Longa五级评分法［6］进行行为学评分，1～3分表示造模成功。假手术组同样定位后置入空针，不注血。凉血通瘀组按照实验动物和人体临床用药剂量换算公式所得剂量，灌胃凉血通瘀方水剂（1.0 mL/100 g）。假手术组、模型组每日给予等剂量蒸馏水灌胃。各组大鼠均连续灌胃3 d后取材。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 行为学评分

按照Longa 五级评分法［6］测评大鼠神经功能缺损程度，再由2 名经过专业培训的研究人员对大鼠评分，计算平均分［7］。

2.2.2 脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达

采用Western Blot 法，加入RIPA 裂解液，使用球磨仪匀浆收集大脑总蛋白，采用BCA 试剂盒、酶标仪定量蛋白浓度，以GAPDH 为内参。室温下配置10%SDS-PAGE，待胶凝固后加入样本，进行电泳及半干转。用脱脂奶粉配置浓度为5%的封闭液，4 ℃条件下孵育一抗过夜，室温孵育二抗2 h，配置曝光反应液，运用超灵敏发光成像仪进行蛋白条带成像及检测，ImageJ软件进行计算和分析相对蛋白灰度值。

2.2.3 脑组织TLR4 mRNA的表达

采用RT-PCR 法，取5 mm3左右大小的大鼠脑组织放置于研磨管中，加入研磨钢珠，按50 mg 组织/mL加入Trizol 裂解细胞，提取总RNA，分光光度计检测脑组织RNA 浓度及纯度。以逆转录试剂说明书为标准配制反应体系，进行逆转录。处理逆转录后的产物，设定PCR 反应程序，使用7500 PCR 仪进行扩增，GAPDH作为内参，利用2-△△CT公式计算目的基因表达量。

2.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行所有数据分析，满足正态分布，则以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析。P≤0.05即为具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠行为学评分比较

与正常组比较，模型组、凉血通瘀组大鼠行为学评分明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，凉血通瘀组大鼠行为学评分明显降低（P＜0.01）。具体见表1。

表1 各组大鼠行为学评分比较（±s，分）

表1 各组大鼠行为学评分比较（±s，分）

注：与正常组比较，$$P ＜0.01；与假手术组比较，**P ＜0.01；与模型组比较，##P ＜0.01。

组别正常组假手术组模型组凉血通瘀组n6 6 6 6 Longa五级评分0 0 1.667±0.516$$**1.167±0.408$$**##

3.2 各组大鼠脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达

与正常组和假手术组比较，模型组大鼠脑组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达皆明显升高（P＜0.01），凉血通瘀组NF-κB p65蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，凉血通瘀组大鼠脑组织TLR4蛋白表达明显下降（P＜0.01），NF-κB p65 蛋白表达下降（P＜0.05）。具体见表2。各组大鼠脑组织TLR4、NF-κB p65电泳图见图1。

表2 各组大鼠脑组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达（±s，灰度值）

表2 各组大鼠脑组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达（±s，灰度值）

注：与正常组比较，$$P ＜0.01；与假手术组比较，**P ＜0.01，*P ＜0.05；与模型组比较，##P ＜0.01，#P ＜0.05。

组别正常组假手术组模型组凉血通瘀组n6 6 6 6 TLR4 0.174±0.928 0.278±0.202 0.633±0.147$$*0.259±0.025##NF-κB p65 0.472±0.712 0.572±0.186 1.106±0.212$$**0.762±0.210$#

图1 各组大鼠脑组织中TLR4、NF-κB p65蛋白电泳图

3.3 各组大鼠脑组织TLR4 mRNA的表达

引物设计见表3。与正常组、假手术组及凉血通瘀组比较，模型组大鼠脑组织TLR4 mRNA的表达明显升高（P＜0.01），凉血通瘀组与正常组及假手术组未见明显差异，见表4。

表3 引物设计

表4 各组大鼠脑组织TLR4 mRNA的表达（±s）

表4 各组大鼠脑组织TLR4 mRNA的表达（±s）

注：与正常组比较，$$P ＜0.01；与假手术组比较，**P ＜0.01；与模型组比较，##P ＜0.01。

组别正常组假手术组模型组凉血通瘀组n6 6 6 6 TLR4 mRNA 1.000±0.000 1.242±0.466 2.242±0.481$$**1.495±0.235##

4 讨论

脑出血属“中风”范畴。卒中后便秘发生率达29%～76%，脑出血更为常见［8-9］。大肠具传导水谷糟粕之功，如果大肠传导失司，阳明热盛，导致热邪与肠内燥屎相结，则浊气上扰，引发神志症状。周老认为本病的主要病机系瘀热，并据此创立凉血通瘀方，以凉血化瘀、通腑泄热为效［10-11］。组方以大黄通腑泻热化瘀、水牛角凉血清热，两药合用重在凉血通瘀；生地黄凉血清热，佐以赤芍、牡丹皮，加强凉血活血散瘀之功效；石菖蒲豁痰开窍，引药上行。本方重在泻热通瘀，顺调气血，给邪以出路，达到以肠治脑之功效。

TLR4/NF-κB 是脑出血损伤后重要的炎症信号通路，NF-κB是炎症信号通路的关键调控靶点，脑出血发生后迅即出现NF-κB活化［12］，诱导炎性细胞因子表达，参与炎症反应；炎性细胞因子又是NF-κB的激活物，所以当NF-κB激活引起炎症反应，则会产生级联放大炎症反应，加重脑损害［13］。TLR4是关键跨膜蛋白，将细胞外抗原识别系统向细胞内传递并引发炎症反应［14］。PEREZPARDO P［15］提示TLR4介导的炎性损伤在神经系统疾病的脑肠炎症反应中发挥重要作用。TLR4信号传导可通过下游因子激活NF-κB信号通路，启动与免疫和炎症反应相关的基因转录，以诱导炎症因子表达［16］，从而放大炎症效应，参与脑出血引发的继发性炎性损伤［17］。

TLR4的升高导致脑出血预后不容乐观，下降则有助于改善脑出血的预后［18］。本研究结果显示，凉血通瘀方干预后脑出血大鼠的TLR4、NF-κB蛋白表达及TLR4 mRNA表达降低，证实凉血通瘀方可抑制TLR4和NF-κB表达，从而证明凉血通瘀方有助于减轻脑炎症损伤，使脑出血的预后得以改善。鉴于中药复方的作用靶点多，本实验研究仅在蛋白、基因水平证实凉血通瘀方抑制TLR4/NF-κB信号通路以减轻脑损害，尚有待进一步进行更深入的研究。