龟鹿二仙膏对阳虚型少弱精子症大鼠的改善作用及CFTR蛋白表达的影响

胡海林，刘子毓，何清湖，3*，周兴

（1. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410036；2. 湘潭县中医医院，湖南 湘潭 411228；3. 湖南医药学院，湖南 怀化 418002；4. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

随着工业化及城镇化的进展以及现代男性生活习惯的改变，男性不育症的发病率逐年提高，约占不孕不育原因的50%［1］。在诸多男性不育的病因中，精子浓度低（少精子症）、精子运动性差（弱精子症）是主要原因［2-3］。少精子症是指男性精液中每毫升所含精子数量＜15×106；弱精子症，又称精子活力低下，是指男性精液中所含的前向运动精子所占百分比＜32%。在男性不育患者中，少精子症与弱精子症常常一起发生，故二者合并称之为少弱精子症。现代医学对此采用手术加以抗氧化剂、激素类等治疗以及辅助生殖技术［4-6］，但是医疗费用昂贵。少弱精子症作为不育问题最常见的疑难病，不仅对男性患者身心造成极大痛苦，而且严重影响家庭和谐及社会的稳定。

中医学文献中无该病名的记载，根据其表现症状，大多归属于“无子”“精少”“精薄”“精清”“艰嗣”等范畴。病机多以肾虚为本，与心、肝、脾密切相关［7-8］。龟鹿二仙膏由鹿角胶、龟甲胶、人参、枸杞子组成。本方源自明代《医便》，称：“此方试极效，专治男妇真元虚损、久不孕育……服此胶百日，即有孕生男，应验神效。”现多用以治疗肾元虚损、精血阴阳不足、筋骨形体失养五脏失充所致的腰膝酸软、形体瘦削、发脱齿摇、阳痿遗精、男子精少不育、未老先衰等诸虚百损之症［9］。中医药能通过调节气血阴阳平衡，取得较好的治疗效果［10-11］，而且拥有简便、价格低廉的巨大优势。

囊性纤维化跨膜传导调节因子（Cystic fibrosis transmembrane conduction regulator，CFTR）是一种通过cAMP 依赖的磷酸化负离子通道调节因子，广泛表达在包括生殖道上皮细胞的各种各样的组织，影响着相应组织细胞的代谢与分泌功能。有研究发现［12-13］，CFTR基因的任何突变均会导致精子功能的改变，其表达量与精子的生成过程、精子活力、获能及顶体反应等呈正相关。目前，国内对CFTR 表达异常的研究重点较多的集中在呼吸道疾病、心血管疾病［14-15］。这些组织中含有大量的阴离子通道：呼吸部的阴离子通道能使呼吸道黏膜保持湿润，将黏液及其附着的灰尘颗粒向外移动，使呼吸道避免受刺激；心肌细胞上的离子通道可以传导生物电活动，引起心肌收缩等。许多研究显示CFTR 蛋白的表达异常与男性不育密切，但是也有研究显示CFTR 蛋白的表达与男性不育，特别是非梗阻性少精子症的发生并无关系［16］。

本研究通过复制少弱精症大鼠模型，观察龟鹿二仙膏对其改善作用，探究其对CFTR蛋白表达的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF 级正常雄性SD 大鼠50 只，5～6 周龄，体质量200～220 g，采购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002。分笼饲养于湖南中医药大学SPF级动物房，动物质量合格证号：43004700058874，自由饮水摄食，饲养实验室温度维持在18～26 ℃，湿度在55%左右，每日常规饲料喂养。

1.2 药物

龟鹿二仙膏组成药物有龟甲胶、鹿角胶、人参、枸杞子，采用单味中药颗粒（华润三九医药股份有限公司，批号：180930）；左卡尼汀口服液（东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：181251）；右归丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：17013609）；腺嘌呤（上海麦克林生化科技有限公司，货号：A6279-100 g）。

1.3 主要设备

电泳仪（中国北京六一生物科技有限公司，货号：DYY-6C）；台式冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司，货号：H1650R）；生物样品均质仪（杭州奥盛仪器有限公司，货号：BioPrep-24）；自动精子分析仪（南宁松景天伦生物科技有限公司，ML-800Ⅲ型）；恒温箱（南京实验仪器厂，HG303-3K）。

1.4 主要试剂

RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0013B）；蛋白酶抑制剂（北京金泰宏达生物科技有限公司，货号：583794）；脱脂奶粉（北京普利莱公司，货号：P1622）；Tris（美国Sigma 公司，货号：V900483）；CFTR 抗体（英国Abcam 公司，货号：ab2784）；β-actin（美国Proteintech 公司，货号：6009-1-Ig）；HRP goat anti-mouse IgG（美国Proteintech 公司，货号：SA00001-1）。

2 实验方法

2.1 分组

将SD 大鼠适应性喂养1 周后，采用随机数字表分为正常组、龟鹿二仙膏组、右归丸组、左卡尼汀组和模型组。每组10只。

2.2 造模方法

根据预实验结果，除正常组外，其余各组每天灌胃300 mg/kg 腺嘌呤，生理盐水配置成的混悬液2 mL/d，连续4周，复制阳虚采用型少弱精子症模型［17-18］。

2.3 给药

造模成功后，按照人与大鼠的体表面积换算相应剂量灌胃。正常组与模型组大鼠给予生理盐水，龟鹿二仙膏组每天给予2.7 g/kg龟鹿二仙膏，右归丸组每天给予右归丸2.6 g/kg，左卡尼汀组每天给予左卡尼汀100 mg/kg。各组大鼠每天灌胃2 mL相应溶液，连续30 d。

2.4 标本采集与处理

2.4.1 精子分析

末次给药24 h 后，以10%水合氯醛3.5 mL/100 g腹腔注射，麻醉后摘取睾丸与附睾，附睾尾部放入4 mL 37 ℃台氏液（需要提前预热）中，用眼科剪充分剪碎，然后用移液枪稍吹打，于37 ℃恒温箱内孵育5 min，然后吸取上层清液稀释6倍（多次试验后的合适浓度）后，取10 μL 悬液滴于精子计数板上，在自动精子分析仪中分析各组精子密度及活力。

2.4.2 HE染色

取睾丸组织多聚甲醛固定，24 h 后脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察睾丸生精小管形态、睾丸组织形态。

2.4.3 Western Blot检测CFTR在细胞中的表达

称取0.02 g睾丸组织，用冰预冷PBS 洗组织，加入200 μL RIPA裂解液，于生物样品均质仪中反复研磨组织，裂解10 min；4 ℃，12 000 rpm 离心15 min。移取120 μL 蛋白上清，加入体积比例为4∶1 的5 × loading buffer（蛋白上清：5×loading buffer），混匀后电泳；转模后封闭；用1 × PBST 将一抗按照CFTR 1∶500、βactin 1∶5 000 稀释孵育90 min，4 ℃过夜，将HRP goat anti-mouse IgG 作为二抗按1∶5 000 比例稀释与膜孵育90 min；ECL 显色曝光：使用ECL 化学发光液与膜孵育1 min，用滤纸吸尽液体，用塑封膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X 胶片曝光20 min；显影冲洗。将曝光后的底片扫描，并用quantity one 专业灰度分析软件进行分析，计算CFTR/actin比值。

2.5 统计学处理

用SPSS21.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，先检测各组数值符合正态分布，然后进行单因素方差齐性检验，再进行单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P≤0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况

正常组大鼠精神状态佳，饮食正常，毛发白而有光泽，活泼好动，四肢温感正常。造模后与正常组相比，造模各组精神萎靡、蜷缩成团，饮食减少，体质量增加减少，甚者后期体质量减轻，毛发粗糙发黄，四肢温感降低，大便稀溏，小便多，呈现一系列阳虚表现。给药后，与模型组相比，体质量增加速度上升，毛发恢复光泽，活动度增加，四肢温感增强，阳虚表现均有所改善。

3.2 龟鹿二仙膏对大鼠精子密度及活力的影响

与正常组相比，模型组的精子密度明显减低（P＜0.01）；与模型组相比，龟鹿二仙膏组、右归丸组、左卡尼汀组大鼠的精子密度明显升高（P＜0.01）；并且龟鹿二仙膏组精子密度稍高于右归丸及左卡尼汀组，但龟鹿二仙膏组与右归丸组及左卡尼汀组大鼠精子密度之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

与正常组相比，模型组的精子活力明显更低（P＜0.01）；与模型组相比，龟鹿二仙膏组、右归丸组、左卡尼汀组大鼠的精子活力明显升高（P＜0.01）；龟鹿二仙膏组与右归丸组及左卡尼汀组大鼠精子活力之间的差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠精子密度及活力的比较（±s）

表1 各组大鼠精子密度及活力的比较（±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.01；与模型组比较，**P ＜0.01，△P ＜0.05。

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3.3 各组大鼠睾丸HE染色

正常组大鼠生精小管饱满，结构完整，小管内生精上皮层数完整，各级生精细胞排列整齐有序，管腔内可见大量成形的精子细胞。模型组大鼠生精小管内生精上皮明显萎缩，排列紊乱，且可见到大量生精细胞的缺失，管腔内几乎无成熟的精子细胞；龟鹿二仙膏组、右归丸组、左卡尼汀组大鼠的睾丸组织得到了一定的修复，生精小管相对饱满，结构趋于完整，各级生精细胞有序，管腔内可见较多的精子细胞。具体见图1。

图1 各组实验大鼠睾丸组织形态（HE染色，×400）

3.4 各组大鼠CFTR蛋白表达情况

与正常组相比，CFTR蛋白在模型组表达明显减低（P＜0.01）；与模型组相比较，龟鹿二仙膏组、左卡尼汀组大鼠的CFTR 蛋白表达明显升高（P ＜0.05），龟鹿二仙膏组与右归丸比较，CFTR 蛋白表达稍弱，但差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2、图2。

表2 各组大鼠CFTR蛋白表达情况的比较（±s）

表2 各组大鼠CFTR蛋白表达情况的比较（±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.01，▲P ＞0.05；与模型组比较，**P ＜0.01。

组别正常组n 5 CFTR蛋白表达量0.33±0.02 0.13±0.03*0.24±0.02**0.32±0.08**▲0.24±0.08**模型组龟鹿二仙膏组右归丸组左卡尼汀组5 5 5 5

图2 各组大鼠CFTR蛋白表达情况的比较

4 讨论

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）包括两个跨膜结构域（TMD1 和TMD2），两个核苷酸结合结构域（NBD1）以及（NBD2）和一个独特的调节（R）区域的ATP结合盒（ABC）转运蛋白［19］。

CFTR 与人类的生育功能密切关联，该基因的突变常引起先天性双侧输精管、附睾以及精囊等缺失，精子输出、成熟和精液的完整性均受到该基因的影响，该基因表达的任何一个方面出现错误，均会引起男性不育症。CFTR 在表达和功能上的缺陷可能会导致流体环境的扰动，从而导致精子质量的降低，引起不育。CFTR 能通过调节负离子的跨膜运输调节细胞内外环境，从而影响相应的组织与细胞的功能。

由于附睾与睾丸周围存在许多交感神经，其中肾上腺素能纤维释放去甲肾上腺素（NA）作用于其上皮的α 和β 两类能受体，当作用于α-肾上腺素能受体时，能够激活Ca2+驱动的Cl-离子通道分泌电解质。而当β-肾上腺素能受体被激活时，cAMP 途径就会被激活，使其驱动的Cl-离子通道分泌出所需的Cl-。正常情况下，这两种离子通道同时存在，并且相互作用。而当Cl-通道分泌受到阻碍时，Cl-分泌减少，从而导致精子浓度，黏度以及管道内蛋白质组分改变［20］。CFTR是人类精子受精能力的重要组成部分［21］。

龟鹿二仙膏中鹿角胶味甘、咸，性温，入肝、肾两经，具有补肾阳、益精血的作用，《神农本草经》言鹿角胶“主伤中劳绝，腰痛羸瘦，补中益气”。龟甲在《神农本草经》曰：“味甘，微寒，主补五脏，安精神、定魂魄、止惊悸；除邪气；开心益智，久服轻身延年。”精子的形成离不开Zn等微量元素和一系列氨基酸等营养物质，并且Zn等能够起到保护精子、维持精子形态和功能的重要作用［22-23］。现代药理学研究发现［24-25］，鹿角胶和龟甲胶中富含精氨酸、谷氨酸、Zn 等多种人体必需的一系列的氨基酸和微量元素。而枸杞子，味甘，性平，归肝、肾经，《神农本草经》曰：“味苦，寒……久服坚筋骨，轻身不老。”枸杞子的相关组成成分能够很好的抗氧化活性，以及修复生精障碍的作用，从而改善生精功能和精子质量［26-27］。

本次实验中，连续给药28 d 后模型组大鼠可见体质量增加、饮食、活动量减少，毛质粗糙发黄、弓背、竖发、尿量增加等肾阳虚证候，模型组的大鼠精子密度、活力较其他组均明显降低；相应模型组大鼠睾丸CFTR 的表达也降低了；表明腺嘌呤诱导大鼠的精子质量低下，并且影响了CFTR 的表达，从而影响大鼠的生育能力。本研究发现模型组大鼠生精小管内生精上皮明显萎缩，排列紊乱，且可见到大量生精细胞的缺失，管腔内几乎无成熟的精子细胞；龟鹿二仙膏组大鼠的睾丸组织得到了一定的修复，生精小管相对饱满，结构趋于完整，各级生精细胞有序，管腔内可见较多的精子细胞。并且龟鹿二仙膏、右归丸对实验大鼠的精子密度以及活力均提升（均P＜0.01）。说明龟鹿二仙膏可增殖生精上皮细胞，增加精子数量。

中医学认为，少弱精子症的病机当以肾精亏虚为主，多见肾阳虚证候，精子的生成障碍，与肾精不足或亏损有关系，并且温阳补肾类的中药组方能够显著干预腺嘌呤所致的生殖功能的损伤［28］。肾为先天之本，藏精主生殖，肾精是生殖之精的基础，生殖繁衍离不开肾精的充盈，先天不足或后天摄生不当，导致肾精匮乏则生殖之精乏源，求嗣多艰［29］。张志聪《黄帝内经素问集注·卷二上》言：“天主生物，地主成物。故阳化万物之气，而吾人之气由阳化之；阴成万物之形，而吾人之形由阴成之。”“阴成形”形成人的形质，“阳化气”推动人体的功能［30］。龟鹿二仙膏由血肉有情之品组成。阴阳并补，补阳而改善外在阳虚表现，滋阴而促进组织修复，促进睾丸上皮细胞和生精细胞的生成，从而改善生精的微环境。灌胃龟鹿二仙膏、左卡尼汀、右归丸后，实验大鼠的睾丸的CFTR 表达得以增加，表达量远高于模型组（P＜0.01）。龟鹿二仙膏可以促进腺嘌呤导致的少弱精子症大鼠睾丸的CFTR 的表达，这与组织形态等宏观表现的改善也一致。由此可见，龟鹿二仙膏可通过促进生精细胞的生成与成长，促进CFTR 蛋白的表达，改善睾丸组织的分泌以及代谢功能，影响精子生成的学流体环境，从而治疗少弱精子症。这也符合中医学中肾为先天之本，主生殖，藏精的藏象理论，肾中精气足则外肾充养，精子产生及活力强。本实验的不足之处是仅设置了一个剂量的龟鹿二仙膏组，没有说明不同剂量的龟鹿二仙膏之间的差异，后期实验有待进一步改善设计方案，以期获得进一步结论。